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几种基于纳米金标记的DNA传感器的研究

作　者: 聂立波
导　师: 何农跃；陈洪
学　校: 东南大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 胶体金标记原位合成纳米金碳糊电极纳米碳管检测灵敏度聚丙烯片生物传感器电极表面东南大学
分类号: Q789
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

基因控制着人类生命的生老病死过程,随着对基因与有关病症的了解,在分子水平上检测易感物种及基因突变,对于疾病的治疗及预后有着重要的意义。随着分子生物学和生物技术的发展, DNA分子的识别技术不断提高。DNA传感器的出现使对目的DNA的测量时间大大缩短,既可定性又可定量,且灵敏度高、选择性好,近年来受到了人们的广泛重视。DNA传感器是集生物分子学技术、现代物理、现代化学、微电子技术于一体而发展起来的新型基因分析技术,可以实现对基因疾病的诊断、传染病的检测、环境监控、药物研究、法医鉴定及食品分析等领域的监测与分析。根据信号转换和检测方法的不同,DNA传感器可分为电化学传感器、光学传感器、石英晶体传感器等。当前,纳米技术与生物传感技术相结合是DNA传感器发展的一大趋势。纳米材料具有独特的物理和化学性质,如量子尺寸效应、小尺寸效应、表面效应和量子隧道效应。功能纳米颗粒(电子、光和磁)可与DNA分子连接,使DNA传感信号得以放大。纳米金颗粒由于制备过程简单,粒径可控,而且具有很好的生物相容性,容易与DNA结合,成为非常适合于在DNA传感器中进行生物标记的纳米粒子。检测灵敏度是DNA传感器一个最重要的性质,本论文在几种不同的DNA检测方法中,以纳米金颗粒为DNA标记物,探索提高DNA传感器检测灵敏度的途径。本论文内容包括以下几个方面:1.聚丙烯基材上的金标银染DNA检测采用聚丙烯微孔膜和致密聚丙烯片为基材,经过氢气/氮气低温等离子技术改性后在其表面接枝活性氨基,以提供原位合成DNA探针序列的活性位点。同时为了开发出适合大面积快速印刷制备生物芯片的方法,对原位合成过程中的氧化剂进行了改进。原位合成后的DNA探针与纳米金标记的靶DNA杂交后进行银染放大检测。实验表明,采用I2/Ac2O/AcOH/THF氧化体系替代I2/H2O/Pyridine/THF氧化体系进行DNA原位合成,可以消除试剂互串对原位合成效率的影响。其原位合成的偶联效率可达98.2%,而且不影响所合成的DNA探针阵列与靶序列杂交的特异性,可很好地区分碱基正错配。以H2和N2混合气体等离子体处理聚丙烯微孔膜和聚丙烯片,光电子能谱(XPS)证实在其表面分别接枝了大量活性氨基,可直接用于DNA的原位合成。实验成功地制备了13nm的胶体金,在聚丙烯片上原位合成DNA探针后的金标银染检测灵敏度达到100 fM,可明显区分碱基正错配,正配:错配一个碱基:错配二个碱基:错配三个碱基的杂交银染信号比为22:16:9:4。聚丙烯片上手工点样DNA探针后的检测灵敏度为100 pM,比原位合成法低3个数量级,而且同一样本DNA浓度下,手工点样的银染信号约为原位合成的1/2。聚丙烯膜上原位合成DNA探针后的金标银染检测信号强于带0.07μmol/ cm2表面氨基的商用聚丙烯膜,且可明显地区分碱基正错配,其金标银染杂交信号随着纳米金粒径和胶体金浓度的增加而增大。2.纳米金放大的电化学DNA检测将纳米材料混入碳糊电极中,分别在纳米碳管改性的碳糊电极和SBA-15分子筛改性的碳糊电极上通过亲和素-生物素法固定DNA探针,固定的探针与纳米金标记的靶DNA杂交后结合第一层胶体金颗粒,并通过layer-by-layer层层放大连接第二层胶体金,最后检测单层和双层纳米金的差分脉冲伏安(DPV)电化学信号。对固定在电极表面的DNA进行循环伏安扫描(CV)表明,在碳糊电极中加入纳米碳管制成的纳米碳糊电极(CNTPE)由于具有比纯碳糊电极(CPE)更大的吸附表面积,固定的DNA量更多,有利于DNA杂交。通过亲和素-生物素体系在电极表面固定DNA,纳米碳管的孔径越大,DNA的固定量越多,DNA的循环伏安(CV)信号也越强。随着电极中纳米碳管的含量增加,杂交信号增强。而碳糊电极经分子筛改性后,由于分子筛不导电,其DNA吸附和杂交的电化学响应信号均低于纯碳糊电极。在纳米碳糊电极表面,经过两次杂交的胶体金层层放大后,其DPV信号明显高于一次杂交的胶体金DPV信号,而且层层放大杂交能很好地区分正错配DNA序列。一次杂交对靶DNA的检测限为1nM,而层层放大的检测灵敏度可达100pM,比一次杂交高一个数量级。3.纳米金质量放大的压电DNA检测压电DNA检测属于对质量敏感的传感,由于纳米颗粒的质量远远大于DNA分子的质量,采用纳米金颗粒标记杂交的DNA,以增加石英金电极表面的质量改变量,并通过layer-by-layer层层放大连接更多的胶体金颗粒,最后检测由表面质量变化引起的频率改变值。实验表明,标记的胶体金确能增加石英晶体的频率检测信号。由于具有更高的杂交效率和胶体金标记效率,先杂交后标记胶体金的“追加标记法”比先标记胶体金后杂交的“直接标记法”具有更大的频率降。直接标记法中,频率改变值随纳米金的直径增大而增加,而追加标记法中,频率改变随纳米金直径的增加而减少。在追加标记法中,在杂交条件优化后,表面探针浓度为1μM,标记胶体金直径为5nm时,一次杂交放大的灵敏度为100fM,去除背景后,正配:错配一个碱基的频率降比值为2.27:1,胶体金层层放大的检测灵敏度为10 fM,去除背景后正配:错配一个碱基的频率降比值为2.13:1。经层层放大后的检测灵敏度比一次杂交时可提高一个数量级。层层放大杂交对MTHFR基因C677T突变纯合型的检测灵敏度达到10fM,并成功地实现了单碱基错配检测,正配:错配一个碱基的频率降比值为2.1:1。

全文目录

摘要  7-10
Abstract  10-14
第一章绪论  14-45
  1.1 DNA 传感器概述  14-15
  1.2 DNA 探针的固定方法  15-18
    1.2.1 DNA 探针及其特性  15
    1.2.2 DNA 探针固定方法  15-18
  1.3 基因芯片的检测方法  18-24
    1.3.1 光学检测方法  19-21
    1.3.2 电化学检测方法  21-22
    1.3.3 压电式检测方法  22-24
  1.4 纳米粒子在生物传感器中的应用  24-29
    1.4.1 声波传感器  25
    1.4.2 光学传感器  25
    1.4.3 磁学传感器  25
    1.4.4 电化学传感器  25-26
    1.4.5 纳米金及其在DNA 检测中的应用  26-29
  1.5 从基因传感器到基因芯片  29-32
  1.6 本论文的主要研究内容  32-34
  参考文献  34-45
第二章聚丙烯材料上的金标银染 DNA 检测  45-72
  2.1 引言  45-52
    2.1.1 基因芯片常用片基及其特点  45-46
    2.1.2 聚丙烯基材的氮/氢等离子处理接枝表面氨基  46-48
    2.1.3 DNA 原位合成  48-50
    2.1.4 金标银染DNA 检测方法  50-52
  2.2 DNA 原位合成非水氧化剂的改进  52-58
    2.2.1 材料与方法  52-54
      2.2.1.1 试剂和仪器  52
      2.2.1.2 实验方法  52-54
    2.2.2 结果与讨论  54-58
      2.2.2.1 控孔玻璃珠柱上寡核苷酸合成的偶联率  54-55
      2.2.2.2 玻璃载片上合成寡核苷酸的荧光和金标银染检测  55-58
  2.3 致密聚丙烯片上的金标银染DNA 检测  58-64
    2.3.1 材料与方法  58-61
      2.3.1.1 实验材料  58-59
      2.3.1.2 实验方法  59-61
        1. 表面等离子处理  59
        2. 寡核苷酸的原位合成  59-60
        3. 寡核苷酸点样  60
        4. 胶体金的制备  60
        5. 巯基DNA 标记胶体金颗粒  60
        6.“三明治”DNA 杂交及银染检测  60-61
      2.3.1.3 表征方法  61
    2.3.2 结果与讨论  61-64
      1. 聚丙烯片的XPS 分析  61-62
      2. 纳米金颗粒的TEM 分析  62
      3. DNA杂交检测的灵敏度  62-64
      4. DNA杂交检测的特异性  64
  2.4 微孔聚丙烯膜上的金标银染检测  64-68
    2.4.1 材料与方法  64-65
      2.4.1.1 实验材料  64
      2.4.1.2 实验方法  64-65
    2.4.2 结果与讨论  65-68
      1. 聚丙烯膜的XPS 分析  65-66
      2. 聚丙烯膜的金标银染杂交信号  66-67
      3. 杂交条件的优化  67-68
  2.4 本章小结  68-70
  参考文献  70-72
第三章纳米金放大的DNA 电化学检测  72-89
  3.1 引言  72-77
    3.1.1 DNA 电化学传感器的原理  72-73
    3.1.2 基底电极  73-75
    3.1.3 DNA 在电极上的固定方法  75-76
    3.1.4 电化学杂交指示剂  76-77
  3.2 材料与方法  77-79
    3.2.1 实验材料  77-78
    3.2.2 实验方法  78-79
      1. 电极的制备  78-79
      2. DNA 固定  79
      3. 金标DNA 杂交  79
      4. 胶体金层层放大  79
      5. 电化学信号检测  79
  3.3 结果与讨论  79-86
    3.3.1 纳米碳管与介孔分子筛性质  79-81
    3.3.2 靶DNA 在不同电极上的吸附  81-82
    3.3.3 靶DNA 在不同孔径纳米碳糊电极（CNTPE）上的吸附  82-83
    3.3.4 碳糊电极中不同纳米碳管含量的影响  83-85
    3.3.5 纳米金颗粒layer-by-layer 信号放大  85
    3.3.6 layer-by-layer 杂交放大的特异性  85-86
    3.3.7 layer-by-layer 杂交放大的检测灵敏度  86
  3.4 本章小结  86-87
  参考文献  87-89
第四章纳米金质量放大的压电 DNA 检测  89-110
  4.1 引言  89-93
    4.1.1 石英晶体的性质  89-90
    4.1.2 QCM 原理  90-92
    4.1.3 压电DNA 传感器的特点与应用  92-93
  4.2 材料与方法  93-98
    4.2.1 实验材料  93-95
    4.2.2 实验方法  95-98
      4.2.2.1 胶体金直接标记检测与追加标记检测  95-96
      4.2.2.2 胶体金质量层层放大  96-97
      4.2.2.3 纳米金放大压电传感器对MTHFR 基因C677T突变纯合型(TT)的检测实例  97-98
  4.3 结果与讨论  98-107
    4.3.1 胶体金直接标记法与追加标记法的比较  98-101
      4.3.1.1 金电极表面探针浓度的影响  99-100
      4.3.1.2 胶体金直接标记法与追加标记法的频率变化  100-101
    4.3.2 胶体金颗粒直径与浓度对频率变化的影响  101-103
    4.3.3 胶体金质量放大检测的特异性与灵敏度  103-105
      4.3.3.1 一次杂交放大的灵敏度与特异性  103-104
      4.3.3.2 胶体金层层放大的特异性与灵敏度  104-105
    4.3.4 对MTHFR基因C677T突变纯合型的检测结果  105-107
  4.4 本章小结  107-109
  参考文献  109-110
第五章结论  110-112
附录  112-115
  博士在读期间参加课题研究情况:  112
  博士在读期间发表的论文:  112-113
  博士在读期间参加的会议:  113-115
致谢  115

几种基于纳米金标记的DNA传感器的研究

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