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血红蛋白与活性氮氧化合物相互作用及其类酶催化机理的研究
作 者: 李得加
导 师: 邹国林
学 校: 武汉大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 血红蛋白 过氧亚硝基阴离子 中间体 类酶催化 反应机理
分类号: Q51
类 型: 博士论文
年 份: 2005年
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内容摘要
血红蛋白(Hb)是血红细胞中的一种主要的血红素蛋白,在体内担负着O2和CO2的转运等功能。除此之外,Hb还具有多种酶活性。本文研究了Hb催化H2O2氧化邻苯二胺(OPDA)反应中间体的特性。用动态快速停留光谱仪跟踪反应,可以捕捉到中间体的吸收峰。在水-正丁醇二相体系中提纯得到稳定的中间体,并证实此中间体在710nm处的吸收峰是与OPDA相关的中间体的吸收峰,在-10℃下中间体的半衰期为一个星期。用紫外-可见光谱、红外光谱和质谱对中间体和产物进行了表征。结果表明产物是2,3-二氨基吩嗪,中间体是比产物多两个氢原子的吩嗪类化合物,分析了中间体的结构并对其进行了命名。结合辣根过氧化物酶(HRP)的催化反应机理和我们的实验结果,提出了一种可信的Hb催化H2O2氧化OPDA的反应机理。 研究了Hb活性中心金属离子对其酶活性的影响。将Mn-原卟啉Ⅸ与脱辅基Hb重组得到Mn取代Fe的重组Hb,用紫外-可见光谱法和SDS-PAGE电泳法对其进行了鉴定。检测了Mn取代Hb的过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性。结果表明,Mn取代Hb的过氧化物酶活性是Hb的70%,过氧化氢酶活性是Hb的1.9倍。 Hb的催化活性与其蛋白质结构也密切相关,研究了Hb的荧光特性与其过氧化物酶活性之间的关系。比较了不同温度、乙醇和NaCl浓度对Hb催化活性、稳定性和荧光特性的影响,比较了Hb在四聚体状态和解离后的二聚体状态的催化活性的变化。当荧光发射峰红移,其催化活力迅速下降,Hb疏水性较高时,
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全文目录
中文摘要 4-6 英文摘要 6-15 第一章 绪论 15-46 1 辣根过氧化物酶(HPR)及其模拟酶 15-20 1.1 HRP的催化反应机理及其模拟酶 15-16 1.2 HRP模拟酶的分类 16 1.3 HRP模拟酶研究现状 16-18 1.4 HRP模拟酶在分析工作中的应用 18-19 1.5 展望 19-20 2 Hb的结构与抗氧化特性 20-25 2.1 Hb的构造 20-24 2.2 Hb的抗氧化特性 24-25 3 Hb的修饰及其电化学活性 25-28 3.1 修饰的Hb作为血液替代品 25-27 3.2 血红素蛋白质的电子传递及电催化特性 27-28 4 酶反应中间体和反应机理 28-35 4.1 活性氧中间体 29-31 4.2 酶反应活性中间体 31-33 4.3 过氧化物酶的反应中间体 33-35 5 过氧亚硝基阴离子 35-46 5.1 生物系统中ONOO~-的产生 35 5.2 ONOO~-的结构与性质 35-37 5.3 ONOO~-与生物物质的作用及生物系统内的影响因素 37-38 5.4 ONOO~-在生物系统中的意义 38-40 5.5 ONOO~-的清除 40-44 5.6 展望 44-46 第二章 血红蛋白催化邻苯二胺氧化反应机理 46-60 1 材料与方法 47-48 1.1 试剂与仪器 47 1.2 产物的制备 47 1.3 中间体的制备 47-48 1.4 快速停流分光光度法测定Hb与H2O2反应的中间体 48 2 结果 48-55 2.1 紫外-可见吸收光谱 48-52 2.2 温度对中间体稳定性的影响 52 2.3 产物、中间体及相关物质的红外光谱 52-55 2.4 OPDA、产物及中间体的质谱 55 3 讨论 55-60 3.1 中间体及产物的结构 55-56 3.2 MetHb的催化反应机理 56-60 第三章 血红蛋白结构与其催化活性之间的关系 60-73 1 材料和方法 61-64 1.1 试剂与仪器 61 1.2 Mn-Hb制备 61-62 1.3 非变性SDS-PAGE检测Mn-Hb- 62-63 1.4 H_2O_2浓度测定 63 1.5 POD活性检测 63 1.6 CAT活性检测 63 1.7 反应体系的荧光光谱 63-64 2 结果与分析 64-70 2.1 Mn-血红素的吸收光谱 64 2.2 Mn-Hb的SDS-PAGE鉴定 64-65 2.3 pH对Mn-Hb催化活性的影响 65 2.4 Mn-Hb的POD活性 65-66 2.5 Mn-Hb的CAT活性 66-67 2.6 Hb的内部荧光性质 67 2.7 不同温度下Hb的荧光光谱和酶学性质 67-68 2.8 不同乙醇浓度对Hb酶学性质和荧光光谱的影响 68-69 2.9 NaCl浓度对Hb稳定性和荧光光谱的影响 69 2.10 高铁Hb的荧光光谱和催化活性 69-70 3 讨论 70-73 第四章 血红蛋白作为标记试剂在酶联免疫分析中的应用 73-79 1 材料与方法 73-75 1.1 仪器和试剂 74 1.2 溶液的配制 74 1.3 Hb-IgG的制备 74 1.4 Hb及Hb-IgG活力的测定 74 1.5 免疫分析 74-75 2 结果与讨论 75-79 2.1 Hb-IgG的制备结果 75 2.2 Hb-IgG催化反应条件的优化 75-76 2.3 Hb-IgG的催化活性 76 2.4 测定人IgG的标准工作曲线及样品分析 76-79 第五章 血红蛋白/聚邻苯二胺膜电极的制各及其电催化性能的研究 79-88 1 材料与方法 79-80 1.1 试剂与仪器 79-80 1.2 POPDA及POPDA/Hb膜电极的制备 80 1.3 红外光谱的测定 80 1.4 Hb活性的测定方法 80 2 结果 80-85 2.1 邻苯二胺的电聚合特性 80-81 2.2 聚合物的红外光谱 81 2.3 Hb在POPDA膜中固定化及其电极特性 81-84 2.4 POPDA膜中固定化Hb的氧化还原特性 84-85 3 讨论 85-88 第六章 过氧亚硝基阴离子对氧合血红蛋白的氧化损伤 88-96 1 材料与方法 89-90 1.1 ONOO~-的制备 89 1.2 oxyHb的制备 89 1.3 ONOO~-与oxyHb的反应 89-90 1.4 ONOO~-对正丁醇抽提液中血红素浓度的影响 90 2 结果 90-93 2.1 ONOO~-浓度的影响 90-91 2.2 温浴时间的影响 91 2.3 CO_2的影响 91-92 2.4 pH的影响 92 2.5 温度的影响 92-93 2.6 ONOO~-对oxyHb正丁醇抽提液中血红素浓度的影响 93 3 讨论 93-96 第七章 过氧亚硝基阴离子及亚硝酸盐对血红蛋白催化反应的干扰 96-108 1 材料与方法 97-98 1.1 试剂与仪器 97-98 1.2 实验步骤 98 2 结果 98-105 2.1 ONOO~-和NO_2~-对OPDA的氧化 98-100 2.2 CO_2对ONOO~-氧化OPDA的影响 100 2.3 ONOO~-对愈创木酚的氧化作用 100-101 2.4 NO_2~-对PR的氧化的影响 101-102 2.5 NO_2~-与H_2O_2和Hb的反应 102-103 2.6 愈创木酚和NO_2~-与ferrylHb的反应 103-105 3 讨论 105-108 研究总结 108-109 研究展望 109-110 参考文献 110-134 博士生在读期间发表和待发表论著目录 134-136 致谢 136-137
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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质
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