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家蚕BmMP54基因与多角体基因的融合表达及其功能的初步研究

作　者: 于滨
导　师: 张耀洲
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 家蚕 BmMP54基因跨膜蛋白荧光定量PCR RNA干扰
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

从本实验室所构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条含312 bp阅读框,编码103个氨基酸残基的序列。该基因序列全长为1086 bp,预测编码蛋白分子量大小为10.463 kD,等电点为9.90。在NCBI上对该序列进行同源性比对后初步发现其为家蚕中的一未知基因,GenBank登陆号为DY231399.1,生物信息学预测其含有2个跨膜区域,将其命名为BmMP54。将BmMP54基因与多角体基因(polyhedrin,Polh)融合并分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1和家蚕杆状病毒表达载体pFastBacHT B中构建重组质粒,分别在大肠杆菌BL21(DE3)和家蚕细胞中表达该融合蛋白。根据cDNA序列的ORF框设计上下游引物,PCR扩增Polh与BmMP54基因片段后分别经BamH I/EcoR I与EcoR I/Xho I双酶切,插入融合表达载体pGEX-4T-1的相应酶切位点,成功构建重组融合蛋白表达质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经PCR、酶切鉴定以及测序分析证实重组正确。用终浓度为1 mM的IPTG诱导重组菌后,裂解菌体作SDS-PAGE分析,在65 kD左右的位置有一浓集特异性蛋白条带,与预期值相符。原核表达的融合蛋白以包涵体的形式存在,利用多角体蛋白的特点,通过调节pH值的方法进行初步纯化,再经阴离子交换层析进一步纯化。利用Bac-to-Bac系统构建含Polh-BmMP54基因的重组病毒vBmPolh-BmMP54 ,并感染家蚕BmN细胞, Western blotting分析表明Polh-BmMP54基因在家蚕细胞中成功得到表达。利用实时荧光定量PCR分析发现BmMP54在五龄幼虫的不同组织中表达量差异较大,其中气门和脂肪体组织中表达量最高,表皮和头部中最低。另外,在RNAi实验中,MTT检测表明BmMP54基因被沉默则增加细胞凋亡,流式细胞仪检测表明细胞会加速BmN细胞进入S期及G2期。BmMP54基因的沉默有助于细胞快速通过G1期的检验点,这说明BmMP54基因可能与阻碍细胞通过检验点有关。本研究为进一步探讨BmMP54基因在家蚕生长、发育过程中的生物学功能打下了良好的基础。

家蚕BmMP54基因与多角体基因的融合表达及其功能的初步研究

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