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烟草花粉萌发和花粉管生长过程中钙调素的分布及功能研究

作　者: 陶文菁
导　师: 吕应堂
学　校: 武汉大学
专　业: 发育生物学
关键词: 钙钙调素绿色荧光蛋白极性分布花粉花粉管定向移动生长速率震荡脉冲生长
分类号: S572
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

Ca²⁺是生物体维持正常新陈代谢和行使生理功能的重要元素。Ca²⁺是细胞刺激-反应信号转导机制中的关键信号分子，在生物体响应外界生物的或非生物的胁迫中发挥重要作用。响应于各种各样的刺激（如光、重力、生物的和非生物的胁迫、激素），植物内Ca²⁺浓度通过增加Ca²⁺内流方式迅速提高，然后经由Ca²⁺外流过程使胞内游离Ca²⁺快速恢复到基础水平，这种过程产生钙信号。各式各样的细胞外刺激引起特异的Ca²⁺浓度升高，Ca²⁺直接的或通过Ca²⁺感应器间接的调节细胞中重要的酶和蛋白质，从而实现对生物体对环境的应激反应以及细胞正常的代谢、生长和分裂等活动的调控。 CaM是生物体内分布最广、最保守的Ca²⁺结合蛋白。CaM是一种酸性小分子蛋白，存在于所有已有研究的真核生物中。CaM作用机制的特征在于它能解码包含Ca²⁺信号的时空模式，从而引发代谢变化和基因表达。CaM通过直接与Ca²⁺相互作用的方式，将偶连的Ca²⁺信号转换为改变下游效应蛋白的活性，从而直接或间接的调控环境胁迫（如触摸和冷休克等）引起的生物体反应，以及细胞生长、分裂、运动、新陈代谢、受精，外界胁迫的应答反应等多种生理过程。作为Ca²⁺的保守受体蛋白，动物和植物中CaM的结构相似，因此Ca²⁺／CaM调控的信号可能也很相似。参照花粉管中Ca²⁺的分布特征，推测CaM也会有类似的顶端聚集的梯度分布。作为细胞内Ca²⁺的主要受体，CaM也参与了极性细胞的顶端生长过程。花粉管是具极性组成细胞质的顶端生长细胞，在植物细胞研究中它们是一类具吸引力的研究模式。花粉的萌发和花粉管生长是一个复杂的动力学过程。作为研究植物细胞生长的模式系统，花粉管生长一直吸引着人们的注意。花粉落在可识别的柱头上，花粉内储存的RNA、蛋白质以及，生物活性小分子启动花粉迅速萌发，生长出的花粉管在花柱内生长，最后到达子房，将两个精细胞释放到胚囊中与卵细胞和中央细胞融合，发生双受精作用。花粉或花粉管细胞感知外部信号后通过信号转导级联反应控制萌发、调招花粉竹’卜长方向，这一系列动力学的细胞事件关系到受精的J戊败。花粉管生长受到细胞内环境的控制，以维持合适的离一子浓度、肌动蛋白、胞吐和胞吞的平衡来实现花粉管的顶端生长。这些过程中Ca2+的作川己经进行的大量研究表明，生长的花粉管顶端存在着指向花粉管顶端逐渐增加的Ca2+梯度。Ca2+在花粉管顶端的聚集伴随着花粉管的振荡生长，同!l寸花粉管顶区C了+的重新分布导致花粉管产生新的生长方向。花粉管生长过程中CaM的作用是植物有性生殖研究的焦点之4。CaM介甘的调竹方式J’一泛存在J几Ca2+通道家族，它通过调控离子运输的方式来控制ca2+的动态平衡，即调节ca2+浓度高一于或低一于某一数值从而花粉管生长能被有效的调控。然而，对J立caM—这种ca2+重要受体，在花粉萌发生长过程中的作用却研究较少。研究CaM分布的方法主要有免疫细胞化学定位法、CaM拮抗剂标记法、mRNA原位杂交及荧光标记CaM或CaM mRNA、GFP一CaM融合蛋亡l定位CaM。我们通过ous或oFP标记eaM，从而在活体细胞内对CaM进行fr寸空观测不l一定位，;卜探讨细胞内CaM的分布特点和细胞功能的相关性。本文构建C“材和G石尸或G以犷的融合基因CaM⁶子’1〕不[I CaM一GUS，少仁分别置J二花椰菜花11卜病毒355启动子和花粉特异启动子LAT52一7控制下，通过农杆菌介导的转化法将植物转化载体转化到烟草（Nieoliana tabaeum SRI）「}’之，我们主要采J月eFP为J反告基因，以转墓Ikl烟草花粉为研究材料，在激光共聚焦扫描系统（confoca曰ascr soanning systcm，cLsM）一卜追踪活体细胞内CaM的11寸“;可分布，从细胞学角度对CaM的生理功能进行研究。主要研究结果如一卜: 1.GUS染色结果以及CaM一GFP荧光检测结果显示，CaM厂一泛分布于植物根、茎、叶等组织，并在生长分裂旺盛、能敏锐感触外界刺激的组织细胞如根尖生长点细胞、根毛细胞、表皮毛细胞、气孔保卫细胞、维管束细胞的细胞质中含量较多。CaM在细胞内呈现出极性分布，主要集中在保卫细胞和表皮毛细胞的相邻两个细胞连接处细胞膜内侧。水合萌发的花粉和正在生长的花粉管中也观察到了CaM，在花粉萌发沟处检测到较高的浓度，少以上CaM在花粉管顶端呈现出梯度分布。研究结果表明，细胞内CaM的不均匀分布可能与细胞功能相关。 2.钙调素幕因和绿色荧光蛋白基因的融合墓因（cam一沙）置于花粉特异启动rLAT52一7调控下，;卜采J一IJ激光共聚焦士l描系统（e（）nfoeal laser seanning system，C比M）对CoM在花粉水合萌发过程f!，的分布进行实11」‘观察。高水，!之的CaM聚集在花粉粒的毛个li)’J发孔处，)卜在‘!二长的花粉管项区（距离顶端仆10卜‘m区域）l一11项端到华部的方向上CaM呈现出山强到弱的梯度分布。在花粉水合萌发过程‘}，，其中一个萌发孔积累了比其他两个萌发孔高得多浓度的olM。当花粉粒水合约90（）、时，分布f细胞质的CaM表现出极性运动，即从细胞质运动到后续时间中（约l37（）s）将长出花粉竹的萌发孔。然而，刚萌发出的花粉管（约2一3卜‘m长）?

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-14
第一章引言  14-36
  一. 植物Ca~(2+)信号系统中的CaM  14-22
    1 Ca~(2+)信号系统简介  14-16
      (1) Ca~(2+)信号转导的基础  14-16
      (2) Ca~(2+)结合蛋白  16
    2 CaM的结构和亚型  16-17
    3 CaM的靶蛋白  17-19
    4 CaM的功能  19-22
      (1) CaM的细胞核功能  19
      (2) 调控离子运输  19-20
      (3) 参与植物对环境的刺激反应  20-22
  二. 花粉的萌发和生长中的信号  22-30
    1 花粉的结构  22-23
    2 花粉的极性生长  23
    3 胞外Ca~(2+)信号及向化性信号  23-24
    4 花粉管生长的向触性信号(粘附信号)  24-25
    5 参与花粉管生长的信号分子  25-30
      (1) Ca~(2+)  25-28
        ① Ca~(2+)在花粉萌发和生长中的作用  25-27
        ② 测量Ca~(2+)_i的方法  27-28
      (2) CaM及CaM结合蛋白  28
      (3) CDPK  28-29
      (4) cAMP  29
      (5) Rop-GTPasc  29-30
  三. 花粉萌发和花粉管生长中的CaM  30-34
    1 CaM在花粉萌发和花粉管生长中的作用  30-31
    2 CaM的研究方法  31-34
      (1) 免疫细胞化学定位法  31
      (2) CaM拮抗剂标记法  31-32
      (3) mRNA原位杂交及荧光标记CaM和CaM mRNA  32
      (4) GFP-CaM融合蛋白定位法  32-34
  四. 本论文研究的目的和意义  34-36
第二章转化载体的构建和烟草转基因体系的建立  36-46
  摘要  36
  一. 引言  36
  二. 材料和方法  36-42
    1 载体的构建  36-38
      (1) 质粒的提取  36-37
      (2) 限制性内切酶消化  37
      (3) 酶切片段的去磷酸化  37-38
      (4) 限制性内切酶片段的回收  38
      (5) 载体和插入片段的连接反应  38
    2 大肠杆菌的转化  38-39
      (1) 大肠杆菌的培养  38
      (2) 大肠杆菌的保存  38-39
      (3) 制备大肠杆菌感受态  39
      (4) 大肠杆菌的转化  39
    3 植物表达载体的构建  39-41
      (1) pMD／CaM-GFP、pMD／GFP、pBI／LAT-CaM-GFP和pBI／LAT-GFP植物表达载体的构建  39-40
      (2) pMD／CaM-GUS和pBI／LAT-CaM-GUS植物表达载体的构建  40-41
      (3) 植物表达载体转化农杆菌  41
    4 农杆菌的转化  41-42
      (1) 农杆菌的培养及感受态的制备  41
      (2) 农杆菌的转化  41-42
    5 烟草转基因体系的建立  42
      (1) 烟草无菌苗的培养  42
      (2) 农杆菌介导的烟草叶盘转化及愈伤组织的筛选  42
  三. 结果  42-43
  附: 所用溶液和配方  43-46
第三章采用GUS标记技术研究CaM在烟草中的分布  46-53
  摘要  46
  一. 引言  46-47
  二. 材料和方法  47-48
    1 载体的构建  47-48
    2 植物转化和组织培养  48
    3 GUS的组织化学检测  48
  三. 结果  48-49
  四. 讨论和分析  49-51
  图版及图版说明  51-53
    3-2 GUS染色显示CaM在转基因烟草中的分布  51-53
第四章 CaM-GFP融合蛋白在烟草中的表达及定位  53-67
  摘要  53
  一. 引言  53
  二. 材料与方法  53-54
    1 观测对象的确定  53-54
    2 叶肉细胞原生质体的提取  54
    3 转基因烟草茎尖分生组织的振荡切片  54
    4 转基因烟草胚囊的分离  54
    5 烟草及拟南芥花粉的萌发  54
    6 显微镜镜检观察  54
  三. 结果  54-55
  四. 分析与讨论  55-57
  图版及图版说明  57-67
    4-1 CaM在转基因烟草幼苗、根和叶片中的表达和定位  57-59
    4-2 CaM在表皮毛细胞、保卫细胞和根毛细胞中的表达和定位  59-61
    4-3 CaM在茎尖分生组织中的表达和定位  61-63
    4-4 转基因烟草的胚珠和胚囊  63-65
    4-5 CAM在花粉和花粉管中的表达  65-67
第五章 CaM在烟草花粉水合及花粉管萌发过程中的极性分布  67-81
  摘要  67
  一. 引言  67-68
  二. 材料和方法  68-69
    1 载体的构建和烟草的转化  68-69
    2 花粉的培养和试剂处理  69
    3 图象的采集和分析  69
  三. 结果  69-70
  四. 分析和讨论  70-73
  图版及图版说明  73-81
    5-2 水合烟草花粉的共聚焦扫描图片  73-75
    5-3 水合花粉和正在生长的花粉管内CaM的分布  75-77
    5-4 花粉萌发过程中CaM的极性分布  77-79
    5-5 没有萌发或CaM拮抗剂处理后的花粉内CaM的分布  79-81
第六章 CaM在转基因烟草花粉管顶区的振荡分布与花粉管脉冲生长的关系  81-102
  摘要  81
  一. 引言  81-82
  二. 材料和方法  82-84
    1 载体的构建和烟草的转化  82-83
    2 花粉的培养及药物处理  83
    3 显微图象的采集和分析  83-84
    4 花粉管生长速率的测量  84
  三. 结果  84-86
    1 CaM在转基因烟草花粉中的极性分布及CaM随花粉管脉冲生长在花粉管顶区的振荡  84
    2 外源Ca~(2+)处理下CaM在花粉管顶区的变化  84-86
    3 CaM拮抗剂calmidazolium对顶端聚集的CaM的影响  86
    4 BFA处理后CaM在花粉管顶区分布的变化  86
  四. 分析和讨论  86-89
  图版及图版说明  89-102
    6-2 花粉管顶区CaM的振荡分布以及花粉管的生长速率  89-93
    6-3 Ca~(2+)处理后花粉管顶区CaM分布和花粉管生长速率的变化  93-97
    6-4 拮抗剂处理后花粉管顶区CaM分布和花粉管生长速率的变化  97-99
    6-5 BFA处理下后花粉管顶区CaM分布和花粉管生长速率的改变  99-102
第七章总讨论  102-105
参考文献  105-122
在读期间发表的论文  122-123
致谢  123

烟草花粉萌发和花粉管生长过程中钙调素的分布及功能研究

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