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小麦淀粉合成关键酶基因启动子的克隆与特征

作　者: 苗红梅
导　师: 韩锦峰；吕德彬；Joy Fleming
学　校: 河南农业大学
专　业: 作物栽培学与耕作学
关键词: gbssI sbeIIa pbf 启动子活性小麦瞬间表达长久表达
分类号: S512.1
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

淀粉是高等植物碳水化合物的主要储存形式。利用基因工程技术对小麦淀粉品质改良是可行且有效的一种方法，而选择适宜的胚乳特异启动子对于特定基因表达调控并实现农作物新品种培育尤为重要。能够在小麦胚乳中表达且表达时间及强度与淀粉合成具有相关性的启动子仍有待克隆和功能分析研究，具有高表达活性的胚乳特异启动子也尚待发现或构建。淀粉合成是一个复杂生化的过程。在此过程中存在四种关键酶：ADP 焦磷酸化酶（AGP）、淀粉合成酶（SS）、淀粉分支酶（BE）和去分支酶（DBE）。在小麦籽粒成熟过程中，此四种酶对淀粉包括直链淀粉和支链淀粉的生物合成数量及比例起重要作用，从而影响淀粉的品质和用途。为了解以上 AGP、GBSS 和 SBE 三个关键酶基因的调控机理及胚乳特异表达特性，本文依据以往小麦淀粉生物合成有关研究结果，进行了以下研究工作：1. gbss、sbeIIa 及 agp 启动子的克隆利用 APCR 和 IPCR 方法对小麦（豫麦 18）gbss、sbeIIa 及 agp基因启动子进行克隆，并对 gbss(GenBankAY278458)4.1Kb 和 sbeIIa(Gen -Bank AY357072)启动子片段 3.09Kb 进行测序和序列分析。在对上述启动子未知片段进行克隆的过程中，也使用了 IPCR 方法，并进行了 Nested PCR 等优化策略。研究利用 APCR 成功地克隆出小麦 i<WP=13>河南农业大学博士学位论文gbssI 和 sbeIIa 启动子序列。2. 小麦胚乳瞬间表达体系的确立本文利用 CaMV 35S-UidA 载体对小麦胚乳瞬间表达体系进行了研究。研究发现，影响小麦胚乳 GUS 活性的因素有多种，包括小麦胚乳年龄、胚乳预培养与否以及轰击压力等。剥离当天的小麦胚乳6-16DPA(day post anthesis)可以用于基因表达活性检测，但以 8-10DPA 为最好，过嫩或过老的胚乳细胞活性明显降低，影响 GUS 表达；剥离后的预培养处理使三倍体的胚乳组织活性降低，不利于 GUS 活性的表达和检测，应以剥离当天进行基因枪轰击为好；可以选择650-1100psi 压力进行基因枪轰击，轰击压力降低到 900psi 时，部分胚乳中 GUS 表达的蓝点数增加，相对降低轰击压力，有利于 GUS 基因的表达和检测。本次研究还对小麦不同品种进行了轰击和 GUS 活性检测，没有发现品种与 GUS 活性之间存在必然的联系。3. sbeIIa 和 pbf 启动子各缺失体的功能缺失研究为对所克隆的 sbeIIa 启动子和与三基因有一定密切关系的调控因子 pbf 启动子功能及活性有所了解，首先利用小麦胚乳瞬间表达系统进行了 sbe.a-g 和 pbf.a-d 启动子缺失体的功能检测。研究结果表明1- 3094 bp 序列(存在于 sbe.g 融合体中)具有稳定的启动子活性， 5’缺失体(sbe.b)的启动子活性明显降低，在缺失-1210- -1bp(sbe.a)情况下，启动子活性仍较高；3’ 缺失体(sbe.c)在缺失-1641--1bp 的情况下，蓝点数目少，GUS 活性极低；在 sbeIIa 启动子中间缺失体中，一些缺失体仅有微弱活性(sbe.f)或没有活性(sbe.d)，当启动子缺失-1579- ii<WP=14>河南农业大学博士学位论文1210 bp 片段(sbe.e)时，仍具有与启动子全长序列(sbe.g)相当的启动子活性。在 pbf 启动子缺失体中，5’和 3’缺失使启动子的活性丧失，中间缺失体(pbf.c)有弱启动子活性，全长启动子序列(含 pbf.d)在 10DPA 胚乳中的最高 GUS 活性为 9.45 蓝点/胚乳，略高于 sbeIIa 启动子。启动子功能缺失研究初步证明一些基序（motifs），如 -300bpelement、G-box 以及 Prolamin-box 等调控因子在决定启动子胚乳特异表达模式中是必需的。研究也发现，改变瞬间表达体系的某一因素（如轰击压力、胚乳年龄等），各缺失体的活性变化规律也有所不同，为进一步验证瞬间表达体系下各缺失体的启动子活性，本文同时进行了sbe.a-g 启动子缺失体在小麦盾片转化试验，并获得部分缺失体的阳性转基因植株，用以 sbe.a~g 的长久表达检测。4. pRgbss 反义表达载体的构建及转化运用反义技术并利用 gbss 基因和自身启动子构建了 gbss 反义基因表达载体 pRgbss，同时将此表达载体转入小麦盾片中并获得转基因植株，为利用基因工程方法改良小麦淀粉品质提供理论基础和有效途径。综上所述，本文对小麦淀粉合成关键酶基因 gbssI、sbeIIa、agp -s以及相关基因 pbf 启动子进行了探索和研究，利用 APCR 技术克隆了gbssI 基因的 1-4010bp 启动子序列和 sbeIIa 基因的 1-3094bp 启动子序列，同时根据 sbeIIa 和 pbf 启动子各缺失体调控下的 GUS 基因表达活性情况，初步确定 sbeIIa 启动子在小麦胚乳中的最短有效片段为 iii<WP=15>河南农业大学博士学位论文-513- -1bp， pbf 启动子有效表达片段为已知 1-2461bp 全长序列并获得 sbeIIa 启动子各缺失体的小麦转化植株；已克隆的 gbssI、sbeIIa和 pbf 启动子序列具有启动子活性，可以用于基因表达构建；在对启动子序列有关基序进行胚乳特异表达的功能分析中，确定-300bpelemen -t、G-bo

全文目录

中文摘要  12-16
第一章综述  16-56
  1 研究目的和意义  16-17
  2 国、内外研究现状  17-47
    2.1 小麦淀粉的研究  17-31
      2.1.1 淀粉  17-18
      2.1.2 淀粉的生物合成  18-19
      2.1.3 淀粉合成关键酶研究进展  19-27
      2.1.4 基因工程改变淀粉品质  27-31
    2.2 启动子的国内外研究现状  31-47
      2.2.1 基因与启动子  32
      2.2.2 什么是启动子  32-33
      2.2.3 真核启动子的特点  33-39
      2.2.4 籽粒或胚乳特异启动子  39-40
      2.2.5 启动子结合蛋白  40-44
      2.2.6 启动子研究方法  44-47
  3 展望  47-48
  参考文献  48-56
第二章论文设计方案及技术路线  56-59
  1 选题依据  56-57
  2 技术路线  57-58
  3 试验内容  58-59
第三章 gbssI、sbeIIa 及 apg-s 启动子克隆  59-94
  1 材料与方法  59-72
    1.1 小麦材料  59-60
    1.2 gDNA 提取  60-62
    1.3 gDNA 酶切及纯化  62-63
    1.4 连接及纯化  63
    1.5 IPCR  63-65
    1.6 APCR  65-67
    1.7 PCR 片段凝胶回收  67-68
    1.8 PCR 产物与 pMD-18T 载体的连接  68
    1.9 质粒-大肠杆菌转化  68-69
    1.10 质粒提取  69-71
    1.11 DNA 测序  71
    1.12 试剂  71-72
  2 结果与分析  72-91
    2.1 小麦总 DNA 提取及浓度检测  72
    2.2 gbss 启动子克隆  72-83
    2.3 sbeIIa 启动子克隆  83-90
    2.4 agp-s 启动子克隆  90-91
  3 讨论  91-93
  参考文献  93-94
第四章 sbeIIa、pbf 启动子缺失表达载体构建  94-118
  1 材料与方法  94-98
    1.1 质粒及引物  94-96
    1.2 DNA 酶切及纯化(略)  96
    1.3 连接及纯化(略)  96
    1.4 DNA 片段凝胶回收(略)  96
    1.5 DNA 片段与载体的连接及转化(略)  96-97
    1.6 质粒提取(略)  97
    1.7 PCR-大肠杆菌转化鉴定(略)  97
    1.8 试剂  97-98
  2 结果与分析  98-115
    2.1 sbeIIa 启动子缺失构建  98-108
    2.2 pbf 启动子缺失构建  108-115
  3 讨论  115-116
  参考文献  116-117
  附表  117-118
第五章小麦胚乳-GUS瞬间表达体系的确立  118-134
  1 材料与方法  118-123
    1.1 小麦材料  118-119
    1.2 质粒提取  119
    1.3 基因枪转化程序  119-122
    1.4 转化后小麦胚乳的培养及检测  122
    1.5 其他试剂  122-123
  2 结果与分析  123-128
    2.1 胚乳细胞预培养与否对基因瞬间表达的影响  123-124
    2.2 胚乳细胞年龄对基因瞬间表达的影响  124-127
    2.3 基因枪轰击压力对基因瞬间表达的影响  127-128
  3 讨论  128-132
    3.1 小麦胚乳瞬间表达体系的应用  128-129
    3.2 瞬间表达强度指标选择  129-130
    3.3 基因表达与胚乳细胞年龄选择的关系  130
    3.4 胚乳预培养与否对 GUS 活性的影响  130-131
    3.5 不同轰击压力对 GUS 表达活性的影响  131-132
  参考文献  132-134
第六章 sbeIIa、pbf启动子缺失体的小麦转化及检测  134-166
  1 材料与方法  134-139
    1.1 小麦材料  134-135
    1.2 质粒提取  135-136
    1.3 基因枪转化程序  136
    1.4 转化材料的培养  136-138
    1.5 转化后小麦胚乳的培养及检测  138
    1.6 试剂  138-139
  2 结果与分析  139-156
    2.1 sbeIIa 各缺失体胚乳中转化与瞬间表达  139-148
    2.2 sbeIIa 各缺失体盾片中长久表达及转基因植株的鉴定  148-150
    2.3 pbf 各缺失体胚乳转化与瞬间表达  150-156
  3 讨论  156-160
    3.1 GUS 瞬间表达体系  156-157
    3.2 sbeIIa 启动子各缺失体的基因瞬间表达  157-158
    3.3 sbe.a-g 各启动子片段序列结构与基因调控特点  158-159
    3.4 pbf 启动子各缺失体的基因瞬间表达  159
    3.5 sbeIIa 启动子各缺失体在盾片中的基因枪转化  159-160
    3.6 启动子的表达强度及应用  160
  参考文献  160-162
  附表及附图  162-166
第七章 gbss 启动子在小麦淀粉品质改良中的应用  166-178
  1 材料与方法  166-169
    1.1 质粒  166-167
    1.2 小麦材料  167
    1.3 DNA 片段凝胶回收(略)  167
    1.4 DNA 片段与载体的连接及转化(略)  167
    1.5 质粒提取(略)  167-168
    1.6 PCR-大肠杆菌转化鉴定(略)  168
    1.7 金粉制备(略)  168
    1.8 基因枪转化(略)  168
    1.9 GUS 检测  168
    1.10 试剂  168-169
  2 结果与分析  169-173
    2.1 gbss 反义基因表达载体构建的设计  169-170
    2.2 gbss 反义基因表达载体构建  170-171
    2.3 pRgbss 表达载体在小麦中的转化  171-172
    2.4 转基因植株的获得及检测  172-173
  3 讨论  173-174
  参考文献  174-175
  附表及附图  175-178
第八章结论与展望  178-181
  1 本文主要研究结果与结论 1  178-179
    1.1 gbss、sbeIIa 及 agp 启动子的克隆  178
    1.2 确立小麦胚乳 GUS 瞬间表达体系  178-179
    1.3 sbeIIa 及 agp 基因启动子的功能缺失研究  179
    1.4 gbss 启动子在小麦淀粉改良中的初步应用  179
  2 创新点  179-180
  3 展望  180-181
英文摘要  181-186
论文发表情况  186

小麦淀粉合成关键酶基因启动子的克隆与特征

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