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太谷核不育小麦（Triticum aestivum）雄性不育相关基因的克隆研究

作　者: 张政值
导　师: 马正强
学　校: 南京农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 小麦核雄性不育 Ms2 SSH TOM7 RAD23 phi-1
分类号: S512.1
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

太谷核不育小麦是我国发现的一个由显性基因Ms2控制的雄性不育突变体。它在轮回选择和群体改良等方面得到了广泛的应用。雄性不育相关基因的克隆有助于了解Ms2基因的作用机制，这无论对基础研究还是应用研究都具有十分重要的意义。本研究以Ms2近等基因系的可育小穗cDNA作为Driver，以不育小穗cDNA作为Tester进行缩减杂交(SSH)，将扩增后的缩减杂交产物进行克隆，构建了一个包含883个重组克隆的SSH文库。分别以可育小穗和不育小穗的cDNA为探针对SSH文库进行差异筛选，结果显示80％以上的SSH克隆在不育系中呈上调表达。在根据插入片段酶切指纹图谱对SSH文库中的414个阳性克隆进行分类的基础上，从12个出现频率较高的类型中各选一个克隆测序。BLAST分析表明这12个克隆中有11个与来源于穗部或减数分裂时期的花药cDNA同源。其中s90与来源于动物、植物和真菌的线粒体外膜移位酶(TOM，translocase of outer membrane)亚基TOM7同源，s106为小麦组蛋白H3的一部分，s210与豌豆休眠相关蛋白基因及杏、烟草等植物的生长素抑制蛋白基因同源，s214为小麦蔗糖：果糖6-果糖转移酶基因的一部分，s598为DNA拓扑异构酶的一部分。上述12个克隆在小麦、簇毛麦、水稻和玉米基因组中均为单拷贝或寡拷贝基因。中国春缺体-四体材料分析表明s36和s90位于第三同源群，s210位于第五同源群，s211、s271、s294和s598位于第六同源群。以s36、s90、s210和s211为探针分别与不同组织和器官总RNA的点杂交表明它们在不育植株的茎杆、小穗和花药等组织中的表达量高于可育植株的相应组织。在其它组织中则没有表现出明显差异。利用RACE-PCR和RT-PCR的方法，我们克隆了小麦TOM7类似蛋白基因的全长cDNA，并将该基因定名为Ttom7。对来自不同物种的TOM7亚基氨基酸序列的比较分析表明其疏水区保守性很高，其它部分则变异很大。为了建立小麦雄性不育EST库和进行相关基因的筛选，我们构建了一个包含150，000个克隆的太谷核不育小麦幼小穗cDNAλ噬菌体文库。文库的重组率为98％，平均插入片段为1.2kb。以s36、s211、s271为探针筛选cDNA文库，获得了这些克------.木谷核不育小麦雄性不育相关基因的克隆研究_隆的同源基因.536的同源序列是一个全长的cDNA，编码一个307个氮基酸的蛋白质，与水稻的一个表达蛋白同源.5271的同源序列的编码区不完整，所编码的多肤与拟南芥一个未知蛋白同源.有趣的是1324bP的sZn同源序列具有cDNA的特征，但没有象样的开放读码框，可能是一个非编码的RNA基因. 在文库筛选过程中，还获得了拟南芥、水稻和油菜花药专化蛋白的小麦同源基因几sP，DNA损伤修复蛋白RAD”类似基因EST和一个磷诱导蛋白类似基因.前两个墓因被定位于小麦第七同源染色体群.

全文目录

摘要  15-17
Abstract  17-19
文献综述  19
一植物核雄性不育  19-23
  (一) 植物细胞核雄性不育的产生及遗传方式  19-20
  (二) 植物核雄性不育的分子机制  20-23
    1 物质或能量代谢缺陷引起雄性不育#  20
    2 影响减数分裂行为的突变与雄性不育  20-21
    3 茉莉酸合成突变与雄性不育  21-22
    4 绒毡层发育异常引起雄性不育  22
    5 其它核基因产生的雄性不育  22-23
二线粒体基因与细胞质雄性不育  23-32
  (一) 植物线粒体基因组的结构及基因的重组  23-24
  (二) 植物线粒体基因的表达调控  24-27
    1 转录和加工水平的调控  24-26
    2 翻译后调控  26-27
  (三) 植物细胞质雄性不育的分子基础  27-30
    1 与植物细胞质雄性不育相关的线粒体基因结构  27-29
    2 植物细胞质雄性不育产生的机制  29-30
    3 与花器官同源异形突变表型相似的细胞质雄性不育  30
  (四) 植物细胞质雄性不育的育性恢  30-32
三. 基因工程创建雄性不育  32-34
  (一) 利用线粒体基因创建雄性不育  32
  (二) 利用基因沉默方法创建雄性不育  32-33
  (三) 通过改变小孢子发育过程关键酶的时序表达获得雄性不育  33
  (四) 利用细胞毒性基因诱导产生雄性不育  33-34
四小麦太谷核不育基因的研究  34-47
  参考文献  36-47
第一章 SSH文库的构建和分析  47-71
  引言  47-49
  材料与方法  49-53
  结果与分析  53-66
    一 cDNA缩减杂交和SSH文库的构建  53
    二 SSH文库的分析  53-57
    三 SSH文库部分阳性克隆的测序、定位和RNA点杂交分析  57-62
    四 s210和s598的生物信息学分析  62-66
      (一) s210可能编码生长素抑制蛋白  62
      (二) s598是一个拓扑异构酶类似基因  62-66
  讨论  66-68
  参考文献  68-71
第二章小麦TOM7基因全长cDNA的分离  71-84
  引言  71-72
  材料与方法  72-73
  结果与分析  73-80
  讨论  80-82
  参考文献  82-84
第三章 cDNA文库的构建与候选基因的筛选  84-102
  引言  84-86
  材料与方法  86-88
  结果与分析  88-102
    一、太谷核不育小麦小穗cDNA文库的构建  88
    二、 s36的全长cDNA筛选  88
    三、 s211全长cDNA的筛选  88
    四、 s271全长cDNA的筛选  88-95
    五从文库中获得的其它EST  95-102
      (一) 花药专化蛋白基因EST  95
      (二) RAD23类似基因EST  95
      (三) 磷诱导蛋白类似基因EST  95-102
讨论  102-104
参考文献  104-106
全文总结  106-107

太谷核不育小麦（Triticum aestivum）雄性不育相关基因的克隆研究

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