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小麦黄花叶病毒侵染性cDNA克隆及细胞侵染体系的建立

作　者: 董家红
导　师: 于嘉林
学　校: 中国农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 小麦黄花叶病毒全长cDNA克隆体外转录侵染体系瞬时表达载体
分类号: S435.12
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
下　载: 314次
引　用: 3次
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内容摘要

在中国，由小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus, WYMV)引起的小麦黄花叶病已严重的危害了小麦的生产。可是，由于寄主植物小麦遗传背景复杂，寄主范围狭窄，机械接种困难，体外病毒粒子不稳定，病毒RNA容易降解等因素，给小麦黄花叶病毒的研究带来了极大的困难。为了对小麦黄色花叶病毒进行深入地分子生物学研究，从细胞及分子水平上认识植物病毒的侵染和复制机制，本研究试图建立一个适于WYMV侵染的室内活体细胞侵染系统，包括病毒侵染性cDNA克隆的构建、烟草原生质体和小麦细胞体系的培养，以及体外转录物的接种和相关的检测技术。该体系的建立为研究其它植物病毒奠定技术基础。本研究首先利用5′RACE方法确认了WYMV-HC基因组的5′端的未知序列，其中RNA1的5′末端多出了15nt(5′-AAAATAAAACCACCA-3′)，RNA2的5′末端则多出了12nt(5′-AAAATAAAACCA-3′)。利用根据末端序列设计的引物，构建了T7启动子驱动下的病毒基因组的全长cDNA克隆。体外转录结果表明所获得的cDNA克隆可以产生相应的WYMV RNAs。用电击穿孔法将体外转录的WYMV RNAs接种于小麦品种鄂恩1号(Triticum aestivum L EEn. No.1)的愈伤组织和烟草悬浮细胞系BY-2的原生质体内，摸索建立了适用于WYMV病毒颗粒及体外转录RNA侵染植物细胞的侵染体系。对被接种细胞进行的Western blot和Northern blot检测结果表明，体外合成的WYMV RNAs可以在烟草细胞系BY-2和小麦细胞内复制、表达，即本研究所构建的WYMV cDNA克隆具有侵染活性。进一步实验还证明RNA1的5′末端序列(无论是日本分离物5′末端序列还是潢川分离物的末端序列，或者是额外加的一个G对都不影响侵染性)及3′末端poly(A)尾长短(带有26个A和4个A)对WYMV体外转录物的侵染活性也没有明显的影响。在此基础上，进一步完善了该侵染体系。另外，本研究还利用这一侵染体系对WYMV RNA2编码的P1蛋白的功能进行了初步研究。通过构建在pSKCaasSK上的GFP与P1融合基因(包括N端和C端)的瞬时表达载体，用电穿孔法转入细胞(烟草原生质体或小麦细胞)，用荧光显微镜观察发现在烟草原生质体内集中在细胞核内发光，而在小麦愈伤细胞内，荧光集中在细胞质内、细胞膜与细胞壁上。分析可能是因为小麦是病毒的天然寄主，所以在小麦细胞内，由于某些因子的存在，P1表现其在天然寄主内的功能，而在非天然寄主烟草细胞内，可能是因为缺乏某些与P1蛋白互作的因子，P1表现异常的定位功能，说明P1的功能与寄主有关，或者说是有寄主专一性的。相对于农杆菌注射法接种单独的GFP于基因烟草16C能引起转最后基因沉默，注射构建在pBIN35S-nos上的GFP与P1融合基因的瞬时表达载体接种转基因烟草16C却能用长波紫外灯观察到更强的荧光表达，初步分析认为，P1蛋白基因可能干扰了转录后基因沉默。

全文目录

第一章文献综述  9-29
  1.1 小麦黄花叶病毒的研究进展  9-18
    1.1.1 生物学特性  9-10
    1.1.2 分子生物学特性  10-16
    1.1.3 大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)病毒的特性  16-18
  1.2 植物RNA病毒的侵染性cDNA克隆  18-21
    1.2.1 侵染性cDNA克隆的构建  18
    1.2.2 侵染性cDNA克隆的类型  18-19
    1.2.3 影响侵染性cDNA克隆生物活性的因素  19-21
  1.3 植物细胞系在分子植物病毒学研究中的应用  21-26
    1.3.1 植物组织细胞的培养  21
    1.3.2 原生质体的分离  21-23
    1.3.3 病毒及病毒RNA对植物细胞和原生质体的侵染  23-26
  1.4 GFP在植物病毒研究上的应用  26-28
    1.4.1 绿色荧光蛋白  26
    1.4.2 应用绿色荧光蛋白研究病毒的运动  26-28
  1.5 研究的目的和意义  28-29
第二章小麦黄花叶病毒侵染性cDNA克隆及细胞侵染体系的建立  29-61
  2.1 材料  29-31
    2.1.1 毒源和血清  29
    2.1.2 菌株、载体和质粒  29
    2.1.3 酶和化学试剂  29-30
    2.1.4 引物  30
    2.1.5 细胞  30
    2.1.6 培养基和缓冲液的配制  30-31
    2.1.7 仪器设备  31
  2.2 方法  31-35
    2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化  31-32
    2.2.2 重组质粒的快速鉴定(Cracking)  32
    2.2.3 质粒DNA的小量提取  32
    2.2.4 质粒DNA的大量提取  32
    2.2.5 DNA片段的回收纯化  32-33
    2.2.6 质粒的酶切和连接方法  33
    2.2.7 PCR反应体系  33
    2.2.8 反转录反应体系  33-34
    2.2.9 体外转录反应体系  34
    2.2.10 植物总RNA的提取  34
    2.2.11 小麦黄花叶病毒提取及纯化  34-35
    2.2.12 病毒RNA提取  35
  2.3 侵染性全长cDNA克隆的构建  35-39
    2.3.1 5′RACE-PCR(Rapid amplification of cDNA End)  35
    2.3.2 T7启动子控制下的全长克隆的构建  35-39
  2.4 细胞组织培养技术  39-40
    2.4.1 小麦愈伤组织的培养和胚性细胞系的建立  39
    2.4.2 烟草细胞的悬浮培养及原生质体的分离  39-40
  2.5 转染  40-42
    2.5.1 小麦细胞的质壁分离转化  40-41
    2.5.2 BY-2烟草原生质体的电击转化  41-42
  2.6 体外转录物接种后的表达检测  42-44
    2.6.1 SDS-PAGE和WesternBlotting检测  42-43
    2.6.2 Northernblot检测  43-44
  2.7 结果与分析  44-56
    2.7.1 5′RACE结果  44-46
    2.7.2 T7启动子控制下的全长cDNA克隆的构建  46-50
    2.7.3 体外转录物对BY-2烟草原生质体和小麦细胞的侵染  50-56
  2.8 讨论  56-61
    2.8.1 侵染性克隆的构建  56-57
    2.8.2 侵染体系的建立  57-61
第三章小麦黄花叶病毒编码的P1蛋白功能的探索性研究  61-76
  3.1 材料  61-62
    3.1.1 引物  61-62
    3.1.2 菌株和植物材料  62
    3.1.3 质粒  62
    3.1.4 仪器设备  62
  3.2 瞬时表达载体的构建  62-68
    3.2.1 pSK76-GFP及pBIN76-GFP的构建  62-64
    3.2.2 pSKP1-GFP及pBINP1-GFP的构建  64-65
    3.2.3 pSKGFP-P1及pBINGFP-P1的构建  65-67
    3.2.4 突变体的构建  67-68
  3.3 电击转化  68
  3.4 农杆菌注射  68
    3.4.1 农杆菌感受态细胞的制备  68
    3.4.2 植物表达载体向农杆菌感受态细胞的转化  68
    3.4.3 Agro-infiltration方法接种本生烟  68
  3.5 GFP荧光观察  68-69
  3.6 结果与分析  69-74
    3.6.1 瞬时表达载体的构建  69-71
    3.6.2 荧光观察  71-74
    3.6.3 农杆菌注射接种观察结果  74
  3.7 讨论  74-76
结论与设想  76-77
参考文献  77-88
致谢  88-89
附录Ⅰ GENE PULSERⅡ使用方法  89-92
  附Ⅰ.1 E.coli转化  89-90
  附Ⅰ.2 附件为CAPACITANCE EXTENDERⅡ(用来电击细胞)  90-91
  附Ⅰ.3 注意事项  91-92
附录Ⅱ Tris-苷氨酸SDS-不连续系统不同浓度凝胶配制用量表  92-93
附录Ⅲ 实验中部分克隆在M13测序引物间的序列  93-94
附录Ⅳ P1蛋白与HC-Pro蛋白氨基酸序列的比较  94-95
附录Ⅴ 缩略词  95-96
作者简历  96

小麦黄花叶病毒侵染性cDNA克隆及细胞侵染体系的建立

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