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丙型肝炎病毒不同基因亚型NS3蛋白酶比较及相关细胞蛋白的筛选

作　者: 毛红霞
导　师: 袁正宏
学　校: 复旦大学
专　业: 病原生物学
关键词: 丙型肝炎病毒 NS3蛋白酶细胞内活性检测系统基因型酶活性差异细胞相关蛋白
分类号: R346
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

丙型肝炎病毒（HCV）感染是一种严重危害人类健康的重要病毒性疾病，已知在80％感染患者引起慢性肝炎，其中超过20％的病人可进一步发展为肝硬化和肝癌。目前已知丙型肝炎病毒（HCV）1b型在致病性和转归上又较1a型严重。鉴于病毒基因编码的NS3蛋白酶为病毒成熟所必需，NS3区基因在不同亚型间的变异比较大，又与HCV的致癌性相关，推测型别间NS3蛋白酶活性的差异可能是导致上述现象的一个原因。本文对此设想进行了探索，首先在细胞系统中对蛋白酶活性在转归不同的亚型间的差异进行了验证；在发现1a、1b两亚型NS3蛋白酶存在活性差异的基础上对其结构学基础进行了分析，并对两亚型NS3蛋白酶对细胞功能的影响及影响蛋白酶的可能宿主细胞蛋白进行了研究。本文在分别获得丙型肝炎病毒1b亚型近全长cDNA模板及1a亚型cDNA模板的基础上，首先建立了一种细胞内NS3/4A-SEAP蛋白酶活性检测系统。其基本原理为NS3-4A与SEAP之间以4A－4B位点相接，SEAP从融合蛋白中释放、分泌入细胞上清依赖于NS3对4A－4B位点的切割，检测细胞上清SEAP活性可间接反映NS3的蛋白酶活性。将HCV NS3/4A基因克隆入pCI-neo载体，并使其下游分别与NS4A/4B的酶作用位点及人分泌性胎盘碱性磷酸酶（SEAP）基因融合，用磷酸钙法将上述重组质粒转染Cos7和HepG2细胞，G418筛选获稳定表达细胞。结果显示瞬时和稳定表达NS3/4A-SEAP的细胞上清中均可检测到SEAP活性，Western和Northern印迹证实有目的蛋白的表达。NS3/4A-SEAP稳定表达细胞株用Pefabloc SC（一种不可逆的强丝氨酸蛋白酶抑制剂）处理后，其上清的SEAP活性明显下降。在瞬时和稳定表达系统内，1b亚型NS3/4A构建的嵌合质粒产生的SEAP活性明显高于1a亚型。在发现1a、1b两亚型NS3蛋白酶存在活性差异的基础上，本文进一步通过序列比较、空间构象分析、功能性片段置换、核苷酸点突变等实验对其遗传学基础进行了探讨。结果表明，两亚型的编码氨基酸中有60个相异氨基酸，呈分散<WP=4>分布，将1b型的功能性片段3P、3H、4A、3P＋4A置换给1a后能提高后者的蛋白酶活性（2.44+0.37 mu/ml）,可达6.75+0.69mu/ml、 8.02+1.37mu/ml、 10.99+0.43mu/ml、 12.63+0.87mu/ml，但均未达到1b的水平（29.44+3.69 mu/ml），提示存在于1a、1b两型间蛋白酶活性的差异是多个氨基酸改变在空间上的一种累积效应。为深入研究NS3蛋白酶对细胞的影响及其在病毒致病中的作用，本研究进一步分别从细胞周期分析和对p21启动子抑制作用两方面研究了不同亚型蛋白酶对细胞功能的影响。研究结果显示，具有较高蛋白酶活性的1b型NS3/4A可促进细胞从G0/G1期向S期的转移，其中G0/G1%在1b型为 48.4/49.7，1a 型为59.35/61.25，而Control 为51.47； S%在1b型为 36.98/31.1，1a型为 19.94/24.03，而Control为 28.87；此外，具有较高蛋白酶活性的1b型NS3/4A对p21控制的基因表达有着明显的抑制作用， Luciferase检测结果显示Control为4891.34+529.27，1b为2021.59+473.99，1a为4669.89+571.54。进一步应用酵母双杂交系统，以NS3蛋白酶为诱饵，筛选了人肝细胞来源的cDNA基因文库，获得了可能与NS3发生相互作用的细胞蛋白--- 纤维蛋白原Bβ多肽（FGB），两者的相互作用通过体外免疫共沉淀试验和细胞内共定位分析进行了验证。应用细胞内NS3/4A-SEAP检测系统发现FGB可以剂量依赖的方式抑制NS3的蛋白酶活性。综合相关的文献报道，可以推测肝细胞在感染初期有可能通过FGB作用于NS3/4A蛋白酶来抑制HCV生活周期，这可能有助于解释病毒在肝脏潜伏和持续存在的分子机制。综上所述，本文建立了一种通过检测NS3/4A-SEAP表达细胞上清SEAP水平评价细胞内NS3蛋白酶活性的方法，并证明可用于筛选抗NS3抑制剂及研究不同亚型HCV的致病机理；研究了存在于1a、1b两型蛋白酶间活性差异的机制，发现是多个氨基酸改变在空间上的一种累积效应，并发现具有较高蛋白酶活性的1b型NS3/4A具有较强的促进细胞从G0/G1期向S期的转移、负调控p21控制的基因表达的作用；获得了一种与NS3发生相互作用、影响蛋白酶活性的细胞蛋白--- 纤维蛋白原Bβ多肽（FGB）。上述结果可部分解释HCV1b型高NS3/4A蛋白酶活性与其较差的临床转归的相关性，并为进一步深入研究丙型肝炎病毒的致病机理和发展抗病毒药物打下了良好基础。

全文目录

前言  9-15
第一部分细胞内HCVNS3蛋白酶活性检测系统的建立  15-35
  引言  15-16
  材料与方法  16-21
  结果  21-29
  讨论  29-31
  结论  31-32
  参考文献  32-35
第二部分 1a、1b亚型NS3蛋白酶差异分子机制的研究  35-56
  引言  35
  材料与方法  35-39
  结果  39-50
  讨论  50-52
  结论  52-53
  参考文献  53-56
第三部分 NS3相关细胞蛋白的筛选及FGB与NS3相互作用的研究  56-80
  引言  56
  材料与方法  56-63
  结果  63-74
  讨论  74-76
  结论  76-77
  参考文献  77-80
论文总结及创新点  80-81
综述  81-93
附录  93-140
致谢  140-141

丙型肝炎病毒不同基因亚型NS3蛋白酶比较及相关细胞蛋白的筛选

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