学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

弓形虫GRA6和SAG1基因克隆及其表达产物的应用研究

作　者: 朱翔
导　师: 陆惠民；黄伟达
学　校: 苏州大学
专　业: 病原生物学
关键词: 弓形虫 表面抗原1(SAG1) 致密颗粒抗原6(GRA6) 酶联免疫吸附试验(ELISA) 胶体金斑点渗滤法(DIGFA)
分类号: R346
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
下　载: 322次
引　用: 2次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


目的：从弓形虫昆山分离株和RH株总DNA中克隆GRA6基因片段，构建重组质粒pGEX-GRA6，与本实验室已构建好的重组质粒pGEX-SAG1分别导入大肠杆菌中表达，且对表达产物进行纯化，以纯化的该两种重组蛋白作为诊断抗原，构建新型弓形虫基因工程诊断试剂盒，用于检测弓形虫感染及鉴别急、慢性期弓形虫病。方法：1．用CF-11纤维素柱快速提纯弓形虫速殖子，抽提弓形虫总DNA；根据基因库已报告的基因序列，设计并合成扩增GRA6基因的一对引物，采用聚合酶链反应(PCR)从昆山分离株和RH株总DNA中分别扩增编码GRA6的基因片段，导入质粒pBluescriptIIS(-)，经DNA测序分析后，从构建好的重组质粒pSK-GRA6中以BamHI和EcoRI双酶切出GRA6基因片段，以相同的酶切位点导入表达质粒pGEX-5X-3，构建重组质粒pGEX-GRA6。将重组质粒pGEX-GRA6转化大肠杆菌BL21-Codon Plus(DE3)-RP菌株中，在IPTG诱导下表达，超声破壁后，SDS-PAGE分析表达产物的表达形式，对上清液中表达产物经硫酸铵沉淀、Sephadex G50脱盐和GST亲和层析柱进行目的蛋白的纯化。通过Western blotting检测其纯化重组抗原的免疫反应性。用获得的纯化GST-GRA6重组蛋白作为包被抗原，建立间接法ELISA检测弓形虫感染者血清特异性GRA6-IgM和GRA6-IgG的诊断方法；用获得的纯化GST-GRA6重组蛋白作为包被抗原，建立胶体金斑点渗滤法(DIGFA)检测弓形虫感染者血清特异性IgM弓形虫GRA6和SAG!幕l州克降表达及其产物的应用中文摘要和工gG的方法。2.将重组质粒pGEX一SAGI转化大肠杆菌BL21一CodonPlus(DE3)一RP菌株中，在IPTG诱导下表达;超声破壁后，sDs一队GE分析表达产物的表达形式。通过改变培养温度和LB培养液pH，诱导重组蛋白在上清液中表达，并对上清液中表达产物经硫酸按沉淀、SephadexG一50脱盐、GST亲和层析柱和sephadexG一1 50凝胶过滤柱进行目的蛋白纯化。通过Westem blotting检测其纯化重组蛋白的免疫反应性。用获得的纯化GST一SAGI重组蛋白作为包被抗原，建立间接ELIsA法检测人血清中弓形虫特异性IgM和IgG抗体的诊断方法。结果1.在我们所比较GRA6 336个碱基中，弓形虫昆山分离株与RH株之间碱基基本一致;得到一分子量为49kDa的重组蛋白，通过westem blotting证实该重组蛋白能被弓形虫感染者血清特异性IgM和IgG所识别。GRA6以融合蛋白(GST一GRA6)的形式在大肠杆菌中得到了高效表达。对表达产物亩溶性分析表明，表达蛋白在上清液中和包涵体中均有表达。在上清中表达的可溶性蛋白经纯化后蛋白纯度可达90%以上。用纯化的GRA6重组蛋白构建的ELISA诊断试剂盒和DIGFA诊断试剂盒对弓形虫感染者血清进行检测，其结果一致。2.在常温条件下(37‘C)，SAGI以融合蛋白(GST一SAGI)的形式在大肠杆菌中得到了高效表达，对表达产物可溶性分析表明，表达蛋白以包涵体形式存在。在低温和升高LB培养液pH条件下，在上清液中得到了可溶性重组蛋白，经纯化后蛋白纯度可达90%以上。Westem弓形虫川之八6和S八(月呆}川克降表达及比产物的应用甲丈、芍吐b!otting分析表明一该纯化蛋白能被弓形虫感染者一血一清所识别。川纯化的SAG!重组蛋白构建的ELISA诊断试剂盒对弓形虫感染者血一清进行sAGI一lgM一ELISA检测，结果显示:该诊断试剂盒只对部分弓形虫多克隆IgM抗体血清呈阳性结果，选用其中一份阳性和一份阴性血清进行免疫印迹试验，其结果与我们用SAGI一IgM一ELISA检测结果相同，表明我们研制的检测SAGI一工gM一ELISA诊断试剂盒司一用于急、慢性期弓形虫感染的鉴别。结论1.①弓形虫昆!_助分离株和RH株GRA6基因片段少匕乎完全一致;②在大肠杆菌中得到了高效表达的可溶性重组蛋白GST一GRA6;③该重组蛋白能被弓形虫感染者血清特异性IgM和工gG所识别，可用于构建具有高度敏感性和特异性的弓形虫感染检测试剂盒。用纯化的GRA6重组蛋白构建的ELISA诊断试剂盒和DIGFA诊断试剂盒对弓形虫感染者血清进行检测，其结果一致。2.①在大肠杆菌中表达了GST一SAGI重组蛋白;②通过改变培养温度和LB培养液pH，首次成功地在上清液中得到了可溶性SAGI重组蛋白;③该可溶性重组蛋白能被急性期弓形虫感染者血清IgM所识别，可用于构建弓形虫检测试剂盒，鉴别急、慢性期弓形虫感染。

全文目录


序言  10-15
第一部分 弓形虫速殖子的分离与提纯及总DNA抽提  15-19
第二部分 弓形虫GRA6抗原基因的克隆与表达  19-33
第三部分 弓形虫SAG1可溶性蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化  33-47
第四部分 弓形虫GRA6可溶性蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化  47-57
第五部分 弓形虫SAG1基因抗原ELISA法诊断试剂盒研制  57-69
第六部分 弓形虫GRA6基因抗原ELISA法诊断试剂盒研制  69-78
第七部分 弓形虫GRA6基因抗原DIGFA法诊断试剂盒研制  78-85
结论  85-88
参考文献  88-95
综述  95-148
攻读学位期间公开发表的论文  148-149
附录  149-158
致谢  158-159

相似论文

  1. Treg/Th17平衡在弓形虫感染致不良妊娠结局中的作用机制研究,R714.2
  2. 探讨弓形虫感染孕鼠对胎盘激素调节功能的影响,R714.2
  3. 河南省部分地区猪弓形虫分离株基因型研究和弓形虫RH株的细胞培养,S852.72
  4. 刚地弓形虫RH株速殖子在鼠星形胶质细胞体外培养的实验观察,R382.5
  5. 刚地弓形虫peroxiredoxin基因的克隆、表达、纯化及免疫保护性研究,R392
  6. 宜昌市禽流感的调查与防制对策研究,S851.3
  7. 弓形虫SAG1基因原核表达与间接ELISA检测方法的建立,Q78
  8. 血浆VEGF对于检测乳腺癌患者术后复发和转移的临床价值研究,R737.9
  9. 血清S-CD105监测术后复发转移性乳腺癌的临床价值研究,R737.9
  10. 肾癌患者血清、组织中转化生长因子β1的表达及其临床意义的研究,R737.11
  11. 家蝇幼虫抗菌肽抗弓形虫作用的初步研究,R96
  12. 弓形虫重组SAG1可溶性表达、鉴定及单克隆抗体的制备,S852.7
  13. 环介导等温扩增检测弓形虫方法的建立及初步应用,S854.4
  14. 弓形虫GJS株微线体蛋白3基因的克隆、表达及鉴定,S852.7
  15. 基于rROP18-rSAG2犬弓形虫ELISA检测技术及药物筛选研究,S855.9
  16. 急性弓形虫小鼠感染模型的建立与抗动物弓形虫病药物的初步筛选,S858.91
  17. 弓形虫培养上清抑制THP-1细胞增殖及诱导凋亡的研究,R382
  18. 弓形虫SAG1-ROP2复合基因疫苗与免疫佐剂pCTA2/B及pmIL-12对小鼠的免疫保护性研究,R392
  19. 弓形虫SAG1、GRA2单基因疫苗及SAG1-GRA2复合基因疫苗的免疫效果研究,R392
  20. 刚地弓形虫SAG2基因的克隆、表达与ELISA方法的建立,S852.7
  21. 河北省动物弓形虫病流行病学调查,S855.9

中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
© 2012 www.xueweilunwen.com