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LCM技术体系的建立及胃癌转移相关基因的筛查

作　者: 王振宁
导　师: 徐惠绵
学　校: 中国医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: LCM 胃肿瘤肝素酶侵袭转移微转移 RhoC 存活素腹腔液
分类号: R735.2
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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引　用: 1次
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内容摘要

前言转移是恶性肿瘤最显著的生物学特性之一，是决定肿瘤预后的关键因素。相对于肿瘤病因学而言，有关转移发生机制的研究起步较晚。肿瘤转移是一个多阶段、多基因调控的复杂病理过程，欲从分子水平了解其机制，就必须准确地分析癌细胞基因结构和表达的动态变化。但肿瘤组织是多种不同细胞群体相互作用的三维空间结构，混杂的正常细胞往往可能掩盖一些重要的遗传学特征，因此，细胞异质性已向传统分子病理学研究提出了挑战。激光捕获显微切割(LCM)是一项在显微镜下从组织切片中分离、纯化单一类型细胞群或单个细胞的新技术，可有效地地解决组织中的细胞异质性问题，是分子病理学和肿瘤基因组学研究的革命性技术。胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，在西方国家，多数病例诊断时已届晚期，其5年生存率极低；在日本和中国，胃癌仍高居恶性肿瘤死亡率的第二位。侵袭和转移是进行期胃癌预后不良的主要原因。随着淋巴结清除术的规范和推广以及综合治疗新技术、新方法的问世，胃癌治疗效果有所提高，但对病期、生物学行为及亚临床转移的判定尚缺乏准确、有效的分子生物学指标，使现代外科治疗仍存在盲目性，因此，急需寻找能反映胃癌生物学行为的分子标志物，建立相应的分子分型标准，以指导外科治疗。进行期胃癌根治术后5年生存率长期徘徊不前，其主要原因是术后腹膜复发转移达半数左右。这源于手术前已有癌细胞穿透浆膜或转移淋巴结被膜脱落入腹腔，日后形成播散转移。传统的细胞学检查预测和诊断腹膜微转移特异性较好，但敏感性偏低；癌胚抗原(CEA)mRNA检查虽敏感性有较大提高，但仍存在一定的假阳性和假阴性结果，因此，寻求新的特异性分子标志物具有十分重要的临床意义。本研究首先建立并完善了LCM分子病理学技术体系，在此基础上筛查并确定了肝素酶、RhoC、存活素三种候选的肿瘤转移相关基因在胃癌演进、转移过程中的作用，继之，探讨以肝素酶和存活素mRNA检测腹腔游离癌细胞的灵敏性和特异性。实验方法 1．利用LCM技术定量获取胃粘膜细胞和癌细胞，提取基因组DNA进行高可信度全基因组DNA扩增（HF－WGAX分别检测产物中不同长度的基因片段，以评价其扩增质量和效率。 2．利用LCM技术定量获取冰冻切片、乙醇或福尔马林固定的石蜡切片中的胃癌细胞，提取DNA行全基因组DNA扩增，分别检测产物中不同长度的基因片段；提取RNA，RT－PCR检测不同长度GAPDH基因CDNA片段，以系统评价不同组织切片制备对LCM技术操作及后续的DNA、RNA分析的影响。 3．收集我院肿瘤外科胃癌病例30例，均行淋巴结清除术，未接受手术前放、化疗。每例分别切取正常胃粘膜、原发癌灶和转移淋巴结组织。对整块组织行肝素酶特异性RT－PCR扩增的同时，应用LCM技术获取正常胃粘膜细胞、原发灶癌细胞、转移淋巴结癌细胞，联合RT－PCR方法检测肝素酶的表达，分析其与胃癌侵袭转移潜能的关系。 4．收集病例同3，联合LCM技术和半定量RT－PCR方法分析胃癌细胞中RhQC基因表达水平与临床病理因素及侵袭转移潜能的关系。 5．收集病例同3，联合LCM技术和RT－PCR方法对比存活素基因在正常胃粘膜、原发癌、转移癌细胞中表达率的变化，探讨其在．胃癌发生、发展和转移过程中可能的作用。 6．利用凝胶电泳和RT－PCR技术比较新的RNAlater处理方法与常规深低温保存对腹腔冲洗液中细胞RNA质量影响的差异，评价应用RNAlater保存腹腔液细胞的可行性。 7．收集我院肿瘤外科手术病例48例，均行术中腹腔液检查，且未接受手术前放、化疗。分别对腹腔液标本行肝素酶特异性引物RT－PCR扩增和常规脱落细胞学检查，分析它们与胃癌临床病理因素及腹膜转移相关因素的关系。 8·收集病例同7，对所得腹腔液标本行存活素特异性引物RT－PCR扩。增，并探讨其与胃癌临床病理因素及腹膜转移相关因素的关系。 9．联合应用肝素酶mRNA、存活素mRNA和常规脱落细胞学三种检查方法检测胃癌腹腔液中游离癌细胞，探讨其临床应用价值。 v·2· WWWWtw．W 结果 1．LCM分子病理学技术体系的建立 LM200型LCM系统，经显微镜下定位，可以准确地将癌细胞从原发灶或转移淋巴结中分离出来，并能计数获取的细胞数。 LC M结合HF－WGA技术，能达到1个细胞所得DNA可进行10次PCR检测的水平，扩增产物中某些片段长度超过500hP。冰冻切片和石蜡切片均能获得较满意的 LCM操作，结合

全文目录

一、中文摘要  3-9
二、英文摘要  9-16
三、英文缩略语  16-17
四、论文主体  17-102
  第一部分 LCM分子病理学技术体系的建立  17-29
    论文一激光捕获显微切割细胞的全基因组DNA扩增  17-23
    论文二比较不同组织切片制备在激光捕获显微切割技术平台的应用  23-29
  第二部分应用LCM技术筛查胃癌转移相关基因的研究  29-64
    论文一肝素酶表达与胃癌侵袭和淋巴结转移的相关性研究  29-41
    论文二 RhoC基因表达上调与胃癌侵袭和淋巴结转移的相关性研究  41-53
    论文三存活素基因在原发和转移胃癌及非癌粘膜中表达的临床意义  53-64
  第三部分肝素酶、存活素mRNA检测胃癌腹腔液游离癌细胞的初步评价  64-102
    论文一一种应用RNAlater保存腹腔液中细胞RNA的新方法  64-69
    论文二肝素酶mRNA检测胃癌腹腔液中游离癌细胞的初步评价  69-81
    论文三存活素mRNA检测胃癌腹腔液中游离癌细胞的初步评价  81-94
    论文四肝素酶、存活素mRNA和细胞学联合检测胃癌腹腔液中游离癌细胞的临床意义  94-102
五、论文图片  102-113
六、致谢  113-114
七、综述一激光捕获显微切割技术的原理及应用  114-121
八、综述二肿瘤转移相关基因的研究进展  121-128
九、综述三肝素酶与肿瘤转移  128-135
十、个人简介  135-136
十一、在学期间发表论文及获奖情况  136-137

LCM技术体系的建立及胃癌转移相关基因的筛查

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