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甘遂醋炙降毒的机理及抗癌活性部位筛选的初步研究

作　者: 曹艳
导　师: 方念伯
学　校: 湖北中医药大学
专　业: 中医基础理论
关键词: 甘遂醋炙急性毒性 MTT HPLC-MS联用技术
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

甘遂具有泻下、抗病毒、抗癌、抗白血病、抗过敏等多种药理作用,但其毒性和刺激性极大的限制了其临床应用。本试验旨在探讨甘遂醋炙降毒的机理,并初步筛选甘遂的抑癌活性部位。方法本实验以甘遂、两种醋炙及其不同极性萃取物为试验样品,采用不同方法进行了研究。采用了文火(A)和武火(B)两种醋炙方法,制得醋炙甘遂A和醋炙甘遂B。并采用改良蔻氏法,以小鼠为实验动物开展了急性毒性试验分别测定了甘遂生品及两种醋炙甘遂的LD50。并考察了甘遂及醋炙甘遂对小鼠的皮肤刺激性。对数据进行了统计学分析。分别以甘遂生品及两种醋炙品的LD50的1/30、1/50、1/70设计高、中、低给药剂量,对小鼠给药一周,采血测定肝肾相关的生化指标,并取肝肾切片做HE染色。采用代谢笼收集了小鼠尿液,观察了甘遂生品及两种醋炙品不同给药剂量对小鼠利尿作用的影响。分别以甘遂生品及两种醋炙品的LD50的1/10、1/20、1/30设计高、中、低给药剂量,对各组小鼠灌胃一周,每天一次,绘制小鼠生存曲线,并进行生存曲线的统计学分析,比较两种醋炙方法对甘遂毒性的差异。采用MTT法观察了甘遂生品、醋炙品醇提物及其不同极性溶剂萃取物对体外培养肿瘤细胞增殖的影响。以甘遂、醋炙甘遂醇提物及其不同极性溶剂环己烷、乙酸乙酯的萃取物和水溶性组分为试验样品,配制成不同的浓度梯度为供试液,分别与体外培养的MCF-7.A549细胞、HepG2细胞作用48h后,观察各供试液对细胞增殖的影响。采用反相高效液相色谱-二极管阵列检测器(RP-HPLC-PAD)和高分辨电喷雾飞行时间质谱(ESI-TOF-MS)联用技术分析甘遂醋炙前后化学成分的变化,初步鉴定出醋炙前后部分变化显著的化学成分。结果：甘遂、醋炙甘遂A和醋炙甘遂B的半数致死量分别为：20±6mg/g; 92±10mg/g; 105±11mg/g。急性毒性试验和刺激性试验均表明：炮制可显著降低甘遂的毒性,两种炮制方法对甘遂的毒性有显著性差别。甘遂经醋炙后,从对小鼠的半数致死量可看出其毒性显著下降,对皮肤的刺激性显著降低,且两种醋炙甘遂半数致死量也有统计学差别(P<0.05)。醋炙后甘遂对小鼠的肝肾毒性显著减小,且武火醋炙甘遂较文火醋炙对小鼠的肝肾毒性更小。甘遂低剂量及醋炙品的中低剂量表现出一定的利尿作用,而醋炙品利尿作用均强于生品。生存曲线分析也表明醋炙甘遂B对小鼠的毒性更小。以上实验结果均表明：醋炙可显著降低甘遂的毒性,而武火所得醋炙甘遂B毒性更小,而仍然保持利尿作用。MTT试验表明：甘遂醇提取对MCF-7有较好的抑制作用,IC50值为202μg/mL,而对A549细胞、HepG2细胞无抑制作用。甘遂乙酸乙酯萃取物和环己烷萃取物对MCF-7有较好的抑制作用,IC50值分别为552μg/mL、378μg/mL,对A549细胞、HepG2细胞仅在高浓度有抑制增殖的作用。甘遂水溶性组分对MCF-7细胞无抑制增殖的作用,而对A549细胞、HepG2细胞低浓度无抑制作用,高浓度有促进增殖的作用。醋炙甘遂的乙酸乙酯部位仍有较好的抑制体外培养的肿瘤细胞增殖的作用,而水溶物即无促进细胞增殖也无抑制增殖的作用。采用了HPLC-MS联用技术分析甘遂醋炙前后化学成分的变化,根据质谱行为及文献参考,定性了21种化学成分,其中有19个为生品和醋炙品均有的成分；醋炙后有2种化学成分有所增加,而有14个成分显著减少,且醋炙甘遂B较醋炙甘遂A降低幅度更大。其中有1个成分经醋炙后消失；而有4种成分为醋炙甘遂B中消失的。新增化学成分1个,且峰面积醋炙甘遂B较A大。结论：通过急性毒性试验、肝肾毒性及利尿作用考察、生存曲线分析,可认为醋炙甘遂B毒性较小,用药更安全。武火醋炙较文火醋炙甘遂的炮制方法好,即将醋浸润的甘遂在280℃以10分钟炒干为佳。由此可见,醋炙火候对甘遂的毒性存在一定影响。因此对甘遂醋炙工艺中明确甘遂醋炙火候的规定是十分必要的。该部分的实验结果为醋炙甘遂工艺中火候把握及临床安全用药提供新的理论依据,进一步解释甘遂炮制降毒的机理奠定了基础,MTT试验研究表明：甘遂及醋炙甘遂的乙酸乙酯部位均表现出一定的细胞毒作用,而水溶性组分存在一定的促进细胞增殖的作用。醋炙后的水溶物无促进细胞增殖的作用,提示,甘遂抑瘤成分可能为存在于乙酸乙酯,促生瘤成分可能存在水溶性组分中。该部分的研究表明乙酸乙酯部位可能为甘遂的抗癌活性部位,为甘遂抗癌活性部位的研究提供了初步的筛选依据,也从细胞水平为甘遂醋炙降毒提供新的理论参考。HPLC-MS联用技术分析甘遂醋炙前后化学成分的变化,初步定性了21种化学成分。从总体上看,甘遂醋炙前后化学成分的变化,主要体现在大多数成分的含量显著降低上,完全消失和新增加的成分不多。可见醋炙降毒的机理主要在于降低其中有些物质的含量,醋炙甘遂B较A降低幅度更大,这也从物质基础的层面揭示了醋炙甘遂B比A毒性小、醋炙降毒的机理。由于炮制前后甘遂的质谱行为存在明显的差异,可采用类似中药指纹图谱的方法将甘遂炮制前后的质谱总离子流图标准化,为其制定定性或半定量的质控标准,用科学的方法来判别炮制程度的方法。从本研究结果可见,将液-质联用技术可用于甘遂醋炙的质量控制。本实验从动物实验,细胞水平及物质基础研究不同层面探讨了甘遂醋炙降毒的机理,并初步确定了甘遂抑癌的活性部位,为揭示甘遂醋炙降毒的机理及其炮制工艺、安全合理用药提供了理论依据,为进一步的甘遂制剂的研究提供质量控制和安全保证的理论平台。

全文目录

中文摘要  4-7
ABSTRACT  7-13
缩略词表  13-14
前言  14-24
  1 研究空白  14-15
  2 本课题采用的研究方法及理论基础  15-21
  3 研究意义和预期结果  21-22
  4 选题设计  22-24
实验部分  24-92
  1 实验用样品制备  24-27
  2 毒性研究  27-42
    2.1 急性毒性试验、皮肤刺激性试验  27-31
    2.2 甘遂及两种醋炙甘遂提取物对小鼠的肝肾毒性及利尿作用研究  31-39
    2.3 生存分析法比较两种醋炙甘遂对小鼠毒性的影响  39-42
  3 各提取物对体外培养的肿瘤细胞增殖抑制试验  42-53
  4 甘遂炮制前后化学成分变化的研究  53-92
    4.1 HPLC法初步测定甘遂炮制品化学成分的变化  53-57
    4.2 液质联用LC/MS-IT-TOF对甘遂炮制前后变化显著成分的分析  57-92
讨论  92-96
结语  96-99
参考文献  99-111
附录  111-119
  1 文献综述  111-118
  2 博士期间发表及待发表的论文  118-119
致谢  119

甘遂醋炙降毒的机理及抗癌活性部位筛选的初步研究

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