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针刺对糖尿病大鼠中枢神经系统PKA-CREB信号转导通路的影响

作　者: 何袁芳
导　师: 晋志高
学　校: 中国中医科学院
专　业: 中西医结合基础
关键词: 针刺脑源性神经营养因子BDNF 蛋白激酶A PKA PKA-CREB传导信号通路
分类号: R245
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

1目的本研究在DM学习记忆障碍模型上,选择PKA-CREB信号通路作为切入点,观察针刺对大鼠学习与记忆的影响,探讨针刺通过调节PKA-CREB传导信号通路对糖尿病脑病大鼠的影响,为针刺治疗糖尿病脑病的机制提供更有效的依据。2材料与方法实验用雄性Wistar大鼠46只,随机分为两组,正常组(NC, normal control)10只,模型组36只。以无菌枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液配制链脲佐菌素按50mg/kg剂量向模型组大鼠腹腔内注入25mg/ml浓度的链脲佐菌素(STZ),造模后第8天作Morris水迷宫行为学测试,30只动物被确认为学习记忆障碍,再将动物随机分为3个组：模型组(DM),针刺组(ACP), BDNF治疗组(BD)。选取督脉的“百会”、“大椎”。电针治疗(2Hz,3mA),留针20min,1次／2天,共治疗10次。BDNF组动物椎管内注射BDNF (20mg/kg体重,生理盐水溶液),第一周两次。动物治疗三周后,再做行为学检测,检测后,取脑,4℃冰箱过夜至组织块沉底。对端脑做额状面冰冻切片,片厚30μm。做原位杂交(PKAmRNA)与免疫组织化学(BDNF, CREB)检测。光学显微镜下观察各组动物脑内的阳性标记物的表达情况。MIS2000图象分析系统进行积分光密度测定。3结果3.1行为学检测结果DM模型组在目标象限停留时间百分比最短,游泳距离的百分比也最短,说明糖尿病组动物存在明显的空间学习记忆障碍,针刺治疗后动物在目标象限停留时间和所游的距离明显优于DM模型组(P<0.05)3.2 BDNF免疫组化阳性标记物的分布BDNF免疫组化阳性反应神经元在海马区域的标记神经元最多,着色最深,体积也较大,大的标记细胞有很长的树突染色,最长的可伸展到海马以外,最多的可观察到五级分支。海马出现的BDNF标记物细胞比较,正常组Nc最高,BD组次之,ACP组再次之,DM组最低,前三组与DM组比较有显著性差异(P＜0.05)。杏仁核、扣带回亦有标记神经元分布,其数量极着色深度都不及前者。针刺组与模型组比较也有明显的统计学差异。3.3 PKAmRNA原位杂交结果PKAmRNA原位杂交结果显示,与BDNF阳性标记细胞不同,PKAmRNA阳性标记神经元不但着色深,而且胞核着色,标记细胞的体积比BDNF阳性标记细胞小,为中等大小最多,形状均为圆形,树突无染色,四组海马阳性标记物细胞比较,正常组Nc最高,ACP组次之,BD组再次之,DM组最低,前三组与DM组比较有显著性差异(P＜0.05)。标记物光密度比较,正常组Nc最高,ACP组次之,BD组再次之,DM组最低,前三组与DM组比较有显著性差异(P<0.05)。杏仁核出现的PKAmRNA标记物的光密度比较,四组比较,正常组Nc最高,ACP组次之,BD组再次之,DM组最低,前三组与DM组比较有显著。3.4 CREB免疫组化阳性标记细胞分布CREB免疫组化阳性标记神经元的体积比BDNF阳性标记细胞小,海马区域的标记神经元最多,着色最深,体积也为中等大小最多,形状均为圆形,树突无染色,四组海马阳性标记物细胞比较,正常组Nc最高,ACP组次之,BD组再次之,DM组最低,前三组与DM组比较有显著性差异(P<0.05)。标记物光密度比较,正常组NC最高,ACP组次之,BD组再次之,DM组最低,前三组与DM组比较有显著性差异(P<0.05)。杏仁核的CREB阳性标记物与海马区域数量较少,标记也较浅,标记物光密度比较,正常组NC最高,ACP组次之,BD组再次之,DM组最低,前三组与DM组比较有显著性差异(P<0.05)。4结论4.1 DM学习记忆障碍模型大鼠海马及杏仁核内BDNF的表达降低,针刺可使其升高。表达BDNF的神经元体积也较大,有很长的树突,最长的可伸展到海马以外,最多的可观察到五级分支。4.2 DM学习记忆障碍模型大鼠海马及杏仁核内PKAmRNA的表达降低,针刺可使升高。4.3 DM学习记忆障碍模型大鼠海马及杏仁核内CREB表达降低,针刺可使其升高。4.4针刺可通过调节PKA-CREB信号通路促进BDNF的合成及分泌,促进神经细胞再生功能,从而可影响学习与记忆。这可能是针刺治疗老年痴呆的神经机制。本文的研究结果证实,DM模型大鼠出现了学习记忆障碍,并伴随有海马和杏仁核内BDNF, PKA, CREB表达的降低,针刺可使模型大鼠的上述变化得到抑制,通过PKA在海马区域增加,调节PKA-CREB通路,提高模型大鼠脑源性神经营养因子BDNF的表达,促进了神经细胞再生功能,从而提高学习与记忆能力。

全文目录

中文摘要  7-10
Abstract  10-13
英文缩略语表  13-15
第一部分文献综述糖尿病脑病研究进展  15-35
  1 现代医学有关糖尿病认知功能障碍的认识及研究  15-28
    1.1 糖尿病脑病与学习记忆  16-17
    1.2 学习记忆发生的有关部位  17-18
    1.3 海马内与记忆有关物质  18-19
    1.4 BDNF在脑损伤及再生修复过程中的作用  19-20
    1.5 PKA.PKC在脑损伤及修复过程中的作用  20-24
    1.6 与中枢神经系统损伤及再生有关的细胞内信号转导通路  24-26
    1.7 与神经中枢系统学习,记忆有关的CREB  26-28
  2 中国医学有关糖尿病认知功能障碍的认识及研究  28-35
    2.1 中医学对神经系统脑病的认识  28
    2.2 中医对糖尿病以及糖尿病脑病的认识  28-29
    2.3 糖尿病脑病与中医经络学说  29
    2.4 糖尿病与针灸  29-30
    2.5 糖尿病对BDNF的研究进展  30-32
    2.6 针刺对PKA,PKC进展  32-35
第二部分实验研究  35-57
  前言  35
  1 材料和方法  35-42
    1.1 实验动物  35-36
      1.1.1 动物及分组  35-36
      1.1.2 建立动物模型  36
    1.2 Morris水迷宫测试  36-38
      1.2.1 隐藏平台获得实验  36
      1.2.2 空间搜索实验  36-38
    1.3 针灸及BDNF治疗  38
      1.3.1 针灸治疗  38
      1.3.2 BDNF治疗  38
    1.4 免疫组织化学实验  38-40
      1.4.1 取材  38
      1.4.2 切片  38-39
      1.4.3 免疫组织化学技术  39-40
    1.5 原位杂交实验  40-41
      1.5.1 取材  40
      1.5.2 组织切片的预处理艏  40-41
      1.5.3 预杂交艏  41
      1.5.4 杂交艏  41
      1.5.5 杂交后漂洗艏  41
      1.5.6 显色艏  41
      1.5.7 显微镜观察  41
    1.6 统计学方法  41-42
  2 实验结果  42-49
    2.1 行为学检测  42
    2.2 治疗后各组行为学检测结果  42-43
    2.3 免疫组织化学结果/原位杂交结果  43-49
      2.3.1 BDNF免疫组化阳性标记物的分布  43-45
      2.3.2 PKAmRNA阳性标记物的分布  45-47
      2.3.3 CREB免疫组化阳性标记细胞分布  47-49
  3 讨论  49-57
    3.1 关于动物模型  49
    3.2 与学习记忆相关的脑结构  49-50
    3.3 BDNF在脑损伤及再生修复过程中的作用  50-53
    3.4 PKA在脑损伤及再生修复过程中的作用  53-54
    3.5 CREB与神经中枢系统学习记忆的关系  54-55
    3.6 PKA-CREB信号传导通路  55
    3.7 糖尿病脑病与针灸  55-57
结论  57-59
参考文献  59-73
致谢  73-74
个人简历  74-75

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