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具有协同作用的抗氧化模拟酶的研究

作　者: 闫飞
导　师: 牟颖；罗贵民
学　校: 吉林大学
专　业: 生物物理学
关键词: 抗氧化酶 超氧化物歧化酶 谷胱甘肽过氧化物酶 谷胱甘肽硫转移酶 催化三联体 活性氧 模拟酶 协同作用
分类号: Q814
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


在机体内,由超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)等组成的抗氧化酶系统的协同作用,能够清除多余的活性氧物种(ROS)使得ROS浓度维持在正常的生理范围内,维持氧化-抗氧化平衡,这对于细胞行使正常的生理功能及适应各种生长环境至关重要。为了深入理解这个复杂而多变的系统,开展对于具有抗氧化协同能力的多功能酶的模拟势在必行。1作为机体内的主要抗氧化酶,SOD与GPx不仅在活性上能协同作用,还能组成相互保护的防御群,更有效的清除机体内自由基,保护细胞免遭氧化损伤,维持体内代谢平衡。我们将具有SOD活性的十七肽和具有GPx活性的十五肽通过一个由三肽组成的Linker串联起来,并通过结构模拟及预测得到新的结构合理,催化机理明确的35肽序列。并利用E. coli掺入铜离子培养系统和E. coli营养缺陷型表达系统把双酶活性中心分别引入到该肽的N、C两端,从而获得兼具SOD和GPx双功能酶活性的抗氧化肽酶。2以天然SOD活性中心的活性部位的最短氨基酸序列为框架,插入了一段十五肽(15P),在不破坏SOD活性部位三维结构的基础上,引入GPx活性部位,构建一个具有精巧的双酶活性中心结构域的六十五肽(65P),经E. coli Cys营养缺陷型菌株可溶性表达后,获得一种具有精巧双功能结构域的新型小肽模拟酶。这种小肽双功能酶的获得,不仅对阐明抗氧酶的协同作用的催化机理有重要意义,而且药用潜力巨大。3以理论预测为基础,向单链抗体scFv-2F3中引入一个催化三联体,酶学性质研究结果表明,引入了催化三联体之后,不仅含硒抗体酶的GPx活性有显著提高,而且其对底物CDNB所展示的GST活性也有一定程度的提高。比起单一引入催化残基Sec,催化三联体的成功引入更有助于提高酶的催化活性,这为人工模拟酶的发展开创了一个新策略。4我们发现一种含碲环糊精GPx模拟物(6-TeOdiCD)对两种底物能展示GST活性,这样,6-TeOdiCD就成为一种多功能小分子抗氧化剂。这个发现为我们继续揭示超分子化学中以环糊精为主体的主–客体作用的本质有重要意义。

全文目录


提要  4-10
第一章 序论  10-44
  1.1 超氧化物歧化酶  11-14
  1.2 过氧化氢酶  14-15
  1.3 谷胱甘肽过氧化物酶  15-20
  1.4 谷胱甘肽硫转移酶  20-22
  1.5 谷胱甘肽还原酶  22-23
  1.6 抗氧化模拟酶  23-24
  1.7 具有抗氧化协同作用的多功能模拟酶  24-35
    1.7.1 兼具多功能酶活性的小分子化合物模型  24-33
    1.7.2 兼具多功能酶活性的生物大分子蛋白模型  33-35
  1.8 参考文献  35-44
第二章 基因工程法制备双活性35 肽  44-71
  2.1 序言  44-45
  2.2 35 肽的设计及构建  45-55
    2.2.1 实验材料  45
    2.2.2 实验方法  45-52
    2.2.3 结果与讨论  52-55
  2.3 双活性35 肽的表达与纯化  55-62
    2.3.1 实验材料  55-56
    2.3.2 实验方法  56-60
    2.3.3 结果与讨论  60-62
  2.4 双活性35 肽酶学性质的研究  62-68
    2.4.1 实验材料  62-63
    2.4.2 实验方法  63-65
    2.4.3 结果与讨论  65-68
  2.5 本章小结  68-69
  2.6 参考文献  69-71
第三章 具有精巧双活性部位的65 肽的研究  71-107
  3.1 序言  71-72
  3.2 65 肽的设计及构建  72-84
    3.2.1 实验材料  72
    3.2.2 实验方法  72-78
    3.2.3 结果与讨论  78-84
  3.3 双活性65 肽的表达与纯化  84-88
    3.3.1 实验材料  84
    3.3.2 实验方法  84-87
    3.3.3 结果与讨论  87-88
  3.4 双活性65 肽的结构表征及酶学性质研究  88-95
    3.4.1 实验材料  88-89
    3.4.2 实验方法  89-90
    3.4.3 结果与讨论  90-95
  3.5 抗氧化协同效应的研究  95-102
    3.5.1 实验材料  95-96
    3.5.2 实验方法  96-97
    3.5.3 结果与讨论  97-102
  3.6 本章小结  102-103
  3.7 参考文献  103-107
第四章 引入催化三联体的含硒单链抗体酶的分子设计和活性研究  107-126
  4.1 序言  107-111
  4.2 突变体表达载体的构建  111-117
    4.2.1 实验材料  111
    4.2.2 实验方法  111-114
    4.2.3 结果与讨论  114-117
  4.3 scFv-2F3 突变体的表达、纯化及酶活性研究  117-122
    4.3.1 实验材料  117-118
    4.3.2 实验方法  118-120
    4.3.3 结果与讨论  120-122
  4.4 本章小结  122-123
  4.5 参考文献  123-126
第五章 环糊精衍生物展示GST活性  126-139
  5.1 序言  126-129
  5.2 环糊精衍生物展示GST活性的研究  129-135
    5.2.1 实验材料  129
    5.2.2 实验方法  129-132
    5.2.3 结果与讨论  132-135
  5.3 本章小结  135
  5.4 参考文献  135-139
作者简介  139
攻读博士期间获得的奖励情况  139-140
攻读博士期间的科研成果  140-143
致谢  143-145
中文摘要  145-149
Abstract  149-151

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 酶工程
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