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不同结构形式的HBx蛋白对其在肝癌细胞HepG2中分布的影响

作　者: 彭亮
导　师: 冯英明；张瑞
学　校: 第四军医大学
专　业: 肿瘤学
关键词: HBx 肝细胞癌 HepG2 定位间接免疫荧光
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 25次
引　用: 1次
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内容摘要

目的:目的:HCC是一种全世界普遍的恶性肿瘤,经常被诊断出来时已到晚期,病死率高。目前的流行病学资料表明肝癌的发生率不断攀升,在接下来的十年中,不仅仅是亚洲,非洲,而且北美和欧洲的肝癌发生率也将会逐年增加。由于其对目前的化疗药物耐药,大多数患者都得不到有效治疗,其它的治疗方法例如切除,移植或经皮和动脉介入疗法其疗效都是极其有限。肝癌的危险因子主要包括:HBV,HCV,AFB1,化学致癌物—二乙基亚硝胺,酒精等。在中国,HBV感染是肝细胞癌(HCC)发生的主要危险因子,并且由其编码的HBx蛋白被认为介导了肝细胞的癌变。HBx蛋白能够引发肝癌发生发展的一个潜在的机制,可能涉及到其细胞内的分布。本研究选用不同的真核表达载体,分别克隆并构建了包含HBX基因或其与GFP以不同方式融合表达的重组质粒,探究不同结构形式的HBX蛋白对其在肝癌细胞内定位和分布的影响。方法:1以本实验室保存的的pcDNA3.0-HBX质粒为摸板,采用PCR方法扩增出Flag-HBX片段,克隆至pMD-18T载体中,测序正确后,分别亚克隆至不同真核表达载体,构建重组质粒pFlag-HBX-IRES2-EGFP, pEGFP-C3- Flag-HBX,pFlag-HBX-EGFP-N3。2.将成功构建的三种真核重组表达质粒瞬时转染肝癌细胞HepG2,通过间接免疫荧光染色显示HBx蛋白的细胞内定位和分布,在CHK Olympus倒置荧光显微镜下观察并拍照,应用AdobePhotoshop7.0和ImageJ两个图像处理软件对照片进行处理。结果:1.三种真核重组质粒经测序,PCR和双酶切鉴定验证其含有HBX片段。2.不同结构形式的HBx蛋白影响了其在肝癌细胞HepG2中的分布和表达水平。构建的pFlag-HBX-IRES2-EGFP质粒能分别表达HBx和GFP蛋白,并观察到GFP蛋白在整个HepG2细胞中是均匀分布的,然而HBx蛋白主要是呈颗粒状分布在细胞核周围。在pEGFP-C3-HBX-Flag质粒转染组中,GFP-HBX融合蛋白主要分布在核周围,呈粗颗粒状,核内有少许分布。在pEGFP-C3-HBX-Flag质粒转染组中,HBX-GFP融合蛋白基本上是均匀分布在整个HepG2细胞中,与以上两组明显不同。相似的是,在核周也有一些散在的颗粒存在,其数量在三组中居中。结论:1.为研究HBx蛋白在肝癌发生发展中的作用提供了有意义的实验依据,尤其是对体外细胞转染结果的解释提供了借鉴。2.病理组织中HBx蛋白的分布检测结果与体外细胞转染实验的检测结果之间存在差异。3.为了在体外实验中能更好地模拟真实的HBV感染情况,应更多的通过构建高频突变或缺失模式的HBx基因重组体混合物,进行低浓度转染。

全文目录

缩略语表  5-7
中文摘要  7-10
Abstract  10-13
前言  13-14
文献回顾  14-29
实验一含HBX 基因的不同真核重组质粒的构建  29-43
  1 材料  29-33
  2 方法  33-40
  3 结果  40-43
实验二间接免疫荧光检测不同结构形式的HBX 蛋在HepG2 细胞内的分布  43-52
  1 材料  43-45
  2 方法  45-49
  3 结果  49-52
讨论  52-54
小结  54-56
参考文献  56-67
附录  67-70
个人简历和研究成果  70-71
致谢  71

不同结构形式的HBx蛋白对其在肝癌细胞HepG2中分布的影响

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