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清毒栓干预宫颈HR-HPV感染局部免疫微环境的实验及临床研究

作　者: 楼姣英
导　师: 金哲
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 清毒栓局部免疫微环境 CD4+CD25+Treg CTL细胞病毒负荷
分类号: R271.9
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的1.通过检测宫颈上皮内瘤变组织局部免疫微环境相关转录因子T-bet、GATA3、Foxp3的免疫组化表达,从细胞水平探讨宫颈上皮内瘤变病程进展与病变局部免疫微环境中Th1、Th2、Treg细胞数量变化的关系2.以SiHa宫颈癌细胞上清液、CTL、Treg淋巴细胞共培养体系作为研究对象,观察Treg、清毒栓对CTLA-4、PD-1的蛋白表达的影响,探索Treg细胞在肿瘤免疫逃逸中的机制,探讨中药清毒栓对局部免疫微环境的作用。3.通过检测清毒栓、安达芬及随诊观察三组经治疗观察3个月后病毒负荷及临床症状积分的变化,判断中药清毒栓的临床疗效。方法实验研究：1.选择经HE染色,病理明确诊断为宫颈炎症及宫颈上皮内瘤变的宫颈组织128例,分为宫颈炎症、CINⅠ级、CINⅡ级及CINⅢ级4组,其中宫颈炎症、CINⅡ级病变组织32例,CINⅠ级34例及CINⅢ级病变组织30例。用免疫组化法检测各组组织中免疫微环境相关转录因子T-bet、GATA3、Foxp3阳性细胞的浸润数量,分析以上三种免疫细胞数量变化与病变进展的关系。2.CCK-8法测定PBMC生长曲线。3.用不同浓度SiHa细胞培养上清液作用于CTL细胞及Treg细胞,流式细胞术检测CD8、Treg细胞比例变化。4.免疫磁珠法分离人外周血CD8+T细胞、Treg细胞,流式细胞术检测分选后细胞的纯度。5.用CFSE标记法检测淋巴细胞增值,了解Treg细胞对CTL细胞的抑制功能。6.CCK8法测定各浓度β-榄香烯、清毒栓对CTL细胞增殖的影响。7.应用Western-Blot检测并比较CTL正常培养组(对照组)、CTL+50%SiHa上清培养组(癌上清组)、CTL+Treg+50%SiHa上清培养组(共培养组)CTL+Treg+50%SiHa上清+8μg/mlβ-榄香烯干预组(β-榄香烯组)、CTL+Treg+50％SiHa上清+2μl/ml清毒栓醇提水沉液组(清毒栓组)五组中CTLA4、PD1的蛋白表达情况。临床研究选取北京中医药大学东方医院妇科门诊2009年8月～2011年1月就诊的宫颈HR-HPV感染的患者共90例。随机分成清毒栓治疗组、安达芬对照组、随诊观察组三组进行治疗观察3个月。用HCⅡ检测子宫颈HPVDNA含量(病毒负荷)的变化,判断清毒栓治疗高危型宫颈HPV感染的临床疗效,同时进行临床症状积分统计分析。结果1.随着宫颈上皮内瘤变病程的进展,转录因子T-be t阳性的Th1类细胞数量增多,各级病变中Thl类细胞数量变化的差异具有显著性(P<0.05)；转录因子GATA 3阳性的Th2类细胞数量减少,其中宫颈炎症与CINⅠ级病变中细胞数量变化差异不显著(P>0.05),各级CIN病变中Th2类细胞数量变化的差异具有显著性(P<0.05)；转录因子Foxp3阳性的Treg细胞数量增多,但在宫颈炎症、CINⅠ级及CINⅡ级病变中Treg细胞数量变化差异不显著(P>0.05),在CINⅢ级病变中,Treg细胞的数量较其他组显著增多(P<0.05)。2.应用CCK-8法测定单个核细胞(PBMC)的生长情况发现细胞在前48h处于生长停滞状态,根据细胞生长曲线,以下实验的检测宜在72h-120h内进行。3.不同浓度SiHa细胞培养上清液作用于CD8+CTL细胞,与空白血清对照组比较,75%培养上清组有统计学差异(P<0.05)；而作用于Treg细胞时,50%培养上清组和75%培养上清组与对照组比较,有统计学差异(P<0.05),故选择75%Siha上清液作为下面实验的干预浓度。4.免疫磁珠法分离人外周血CD8+T及CD4+CD25+T细胞,经流式细胞术检测CD8+纯度为87.37±0.93%,CD4+CD 25+T细胞纯度为89.12±2.17%。5.利用CFSE标记CTL,与Treg共培养4天后,CFSE呈单峰,未见明显增殖,而CTL单独培养4天后,可见CFSE呈双峰,即开始出现了细胞增殖,表明Treg对CTL增殖有明显抑制作用。6.4μg/ml.6μg/m 1.8μg/ml的β-榄香烯均可促进CTL增殖,选择较高的药物浓度8μg/ml作为后续实验的药物干预浓度。1μl/ml.1.5μl/m 1.2μ1/m l的清毒栓醇提水沉液均可促进CTL增殖,选择较高的药物浓度2μl/ml做为后续实验的药物干预浓度。7.经Western-Blot检测并测定电泳条带灰度值,CTL与Treg共培养组CTLA4、PD1的蛋白表达量明显增加,β-榄香烯及清毒栓干预后CTLA4、PD1的蛋白表达量显著降低,且清毒栓组蛋白表达量降低的更加明显。说明β-榄香烯、清毒栓都可以抑制Treg对CTL中CTLA4.PDl蛋白的上调作用,且清毒栓的作用更显著。8.清毒栓与安达芬都能有效的降低HC-ⅡHPVR2u/co比值即HPVDNA病毒负荷量,治疗前后自身对照结果有统计学意义(P<0.05),两组比较无显著性差异,与随诊观察组比较有统计学差异(P<0.05)；同时发现两种药物对临床症状、体征的改善作用明显,自身前后对照统计学差异极显著(P<0.01),与随诊观察组比较统计学差异也极显著(P<0.01)。结论1.宫颈病变局部免疫微环境中的Th1、Th2类细胞及Treg细胞都参与了宫颈上皮内瘤变的免疫反应,Treg细胞可能通过免疫抑制作用参与病变进展。2.清毒栓可以降低CTL中CTLA4、PD1蛋白的表达,可能是通过抑制Treg细胞的功能来降低CTLA4、PD1蛋白的表达,从而改变局部免疫微环境而达到抑制肿瘤的作用3.清毒栓能有效降低宫颈高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染的病毒负荷。并能有效改善临床症状、体征。

全文目录

中文摘要  4-7
ABSTRACT  7-11
英文缩略语  11-12
上篇:文献综述  12-32
  综述一:宫颈HR-HPV感染与局部免疫微环境的关系  12-26
    参考文献  21-26
  综述二:中医药对宫颈HPV感染的新认识  26-32
    参考文献  30-32
中篇:清毒栓对宫颈HR-HPV感染SiHa-Treg-CTL体系免疫微环境的调控  32-70
  实验一宫颈上皮内瘤变免疫相关转录因子的表达  32-40
    1.材料与方法  32
    2.实验方法  32-33
    3.实验结果  33-37
    4.讨论  37-38
    参考文献  38-39
    附图  39-40
  实验二清毒栓对宫颈HR-HPV感染SiHa-Treg-CTL体系免疫微环境的调控  40-70
    前言  40-41
    一 CCK-8法测定PBMC生长曲线  41-44
      参考文献  43-44
    二 SIHa细胞培养上清液对BPMC中 CDS‘T、Treg细胞比例的影响  44-48
      参考文献  46-48
    三免疫磁珠法分离人外周血CDST+细胞  48-50
    四免疫磁珠法分离人外周血Treg细胞  50-55
      参考文献  54-55
    五 Treg细胞扩增及功能检测  55-58
      参考文献  57-58
    六 CCSK法测定药物对CTL细胞增殖的影响  58-61
    七中药对SIHa-CTL-Treg共培养体系中CTL细胞CTLA-4、PD-1 蛋白的影响  61-69
      参考文献  68-69
    附图  69-70
下篇:清毒栓治疗宫颈HR-HPV感染的临床对照研究  70-85
  前言  70-71
  临床资料  71-72
  诊疗标准  72-75
  结果  75-78
  讨论  78-83
  参考文献  83-85
结论  85-86
致谢  86-87
个人简历  87-89
附表  89-96

清毒栓干预宫颈HR-HPV感染局部免疫微环境的实验及临床研究

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