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花椰菜和大白菜新种质创制

作　者: 盛小光
导　师: 朱月林；刘凡
学　校: 南京农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 远缘杂交 原生质体融合 杂种鉴定 减数分裂异常 杂种育性 有性杂交 胚挽救 基因组原位杂交 黑腐病抗性
分类号: S634.1
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


花椰菜(Brassica oleracea var. botrytis)为十字花科(Cruciferae)芸薹属甘蓝种的一个变种,生产中常遭受多种病、虫害的威胁,如黑腐病、黑胫病、根肿病和蚜虫等,严重影响其产量和品质。在花椰菜常规种中,上述病、虫害的抗性资源匮乏或者单一,而在十字花科野生植物中存在丰富的异源高抗基因资源。应用体细胞杂交技术,可以克服常规种间杂交不亲和性,获得种间杂种,转移来自不同物种的异源抗性基因,丰富育种材料抗性基因的遗传多样性,创制新的抗病、虫种质。本研究第一部分是利用体细胞杂交技术向芸薹属甘蓝类蔬菜转移野生抗病、虫等优良性状。紫罗兰(M. incana)为十字花科紫罗兰属的一个野生种,具有很高的ω-亚麻酸含量以及优良的蚜虫抗性等。本实验建立了花椰菜和紫罗兰原生质体的PEG融合及培养技术,首次成功获得了紫罗兰与花椰菜的属间体细胞杂种再生植株,并对再生株的形态学,分子标记特征,染色体数目,细胞DNA含量等指标进行了系统的分析,为异源优异种质的利用建立了体细胞杂交技术基础。黑芥(B. nigra)为芸薹属三个基本种之一,多为野生状态存在。黑芥中存在对黑腐病、黑胫病、根肿病等病害高抗、多抗性的基因型。本实验室通过体细胞杂交技术,获得了众多花椰菜与黑芥体细胞杂种。本研究对利用非对称体细胞杂交技术获得并成功移入温室的79个花椰菜和黑芥的杂种进行全生育期的生物学特性调查,内容包括植株形态学观察、细胞DNA含量测定、染色体计数、基因组组成、育性调查等。通过胚挽救技术获得了部分杂种的回交后代植株并对其部分生物学特性也进行了调查,同时对杂种一代及其回交后代进行了黑腐病抗性鉴定。本研究第二部分是利用远缘有性杂交手段向白菜中转移野生种黑芥的抗病性状。大白菜(Brassica campestris ssp. pekinensis)是我国重要的蔬菜作物之一。在种植过程中,常遭受黑腐病、黑胫病和根肿病等病菌的侵染,致使产量下降。通过远缘有性杂交手段把黑芥的抗病性转移到白菜中,对白菜的育种将具有重要意义。本实验以品质优良的感病大白菜为母本,黑芥为父本进行杂交,并对获得的F1代植株进行了形态学,细胞学和分子标记三种手段分析鉴定。通过胚珠和子房培养等胚挽救技术成功获得了回交后代,初步的黑腐病菌人工接种鉴定结果表明,部分回交二代杂种植株中仍具备良好的黑腐病抗性。主要实验结果如下：1.成功建立了紫罗兰和花椰菜属间体细胞杂交体系,获得了118株再生植株,并对它们进行了形态学调查、RAPD和SRAP分子标记鉴定,同工酶谱分析,染色体计数和流式细胞术核DNA含量检测,表明二株为真杂种,且均为混倍体,染色体数变化范围为26到48条。对不同鉴定方法的比较显示,形态学鉴定直观、简便,有较高的判断率,但SRAP分子标记鉴定更准确可靠。获得的紫罗兰和花椰菜属间体细胞杂种植株在移栽入地后,生长缓慢,没有达到成株期。2.对成功移栽入温室的79株花椰菜和黑芥的体细胞杂种进行了全生育期性状调查分析,内容包括细胞DNA含量测定、染色体计数、植株形态学观察和育性调查等。杂种形态变异广泛,多数呈中间类型,少数呈偏亲性状；杂种细胞DNA含量不一致,呈现大于、等于和小于双亲细胞DNA含量之和的三种类型；DNA含量大于双亲之和的杂种中,有较高比例的材料叶型出现畸形和(或)植株生长势弱,育性差。显示出杂种植株的生长势和育性与细胞的DNA含量具有一定的相关性。通过染色体计数,发现所检测杂种多为混倍体,即同一植株的细胞有多种染色体数目构成。在79个杂种中,筛选出13个目标材料,生长势较强,有较好或一定程度的育性,表明采用体细胞杂交技术手段来改良甘蓝类蔬菜的遗传多样性具有可行性。3.根据结实与否选取了可育和不育杂种各二株,对其生物学特性进行了对比分析。不育杂种的花粉母细胞(PMCs)减数分裂行为异常的比例远高于可育杂种,出现了大量的染色体桥,染色体滞后,染色体不均等分裂等异常行为；对PMCs终变期观察表明：不育杂种中出现了大量单价体；可育杂种中,二价体数目明显提高,单价体数目较少。基因组原位杂交(GISH)结果显示：可育杂种的体细胞染色体数为供、受体染色体数之和,为对称杂种；不育杂种细胞中含有受体花椰菜的全部基因组以及附加的3-12条供体完整染色体,为低度非对称杂种。且附加的黑芥染色体在减Ⅰ期均出现染色体滞后,染色体不均等分裂等异常行为。对可育和不育杂种的基因组SRAP分子标记分析表明：杂种DNA均有重组发生,且可育杂种的平均新带比例略大于不育杂种。4.对10个株系的15株BC1杂种进行了生物学特性调查,内容包括细胞DNA含量测定、染色体计数、植株形态学观察和花粉活力调查等。杂种形态多呈中间类型,有三棵植株形态明显趋向于受体花椰菜。核DNA含量和染色体数目均不一致,显示出混倍特性,但相比于体细胞杂种一代,其变化范围明显变窄,且有接近于受体花椰菜的趋势。以花椰菜为父本,共有4个BC1植株获得自交和回交种子,一颗植株通过胚挽救技术获得回交二代胚苗。5.采用从北京,湖南等全国六个省份收集并经过鉴定确定的8个黑腐病菌种以及从英国引进的分别属于RaceⅠ和RaceⅣ的二个生理小种,共10个黑腐菌种对融合亲本花椰菜和黑芥进行苗期抗病性鉴定。筛选出了一个受体(花椰菜)的病情指数为70.4,为“高感(HS)”级别,同时供体(黑芥)的病情指数为8.8,达到“高抗(HR)”级别的黑腐菌种CH5。用筛选的黑腐菌种CH5对体细胞杂种一代及其回交后代植株进行抗病性鉴定,结果显示部分回交二代杂种植株仍具有良好的黑腐病抗性,病情指数为15.7,达到“抗病(R)”级别。6.对获得的10株白菜×黑芥的F1代植株,经形态学,细胞学和SRAP等方法鉴定出6株为真杂种。其中有一株杂种(H1)体细胞含有26条染色体,GISH结果显示其基因组组成为ABB型,育性相对较高,获得了175粒回交一代种子；其它5株杂种50%以上的体细胞含有18条染色体,GISH结果显示其基因组组成为AB型,花粉完全败育,通过胚挽救技术也未获得回交后代。由此推测,染色体数目的增多和同源染色体的配对有利于提高杂种的育性。7.白菜-黑芥杂种与白菜的BC1代植株形态学上趋向于母本大白菜,表现出明显的杂种优势。细胞学观察发现不同BC1代杂种细胞染色体数目略有不同,但多为28条,GISH结果显示其基因组组成为AAB型,花粉活力明显提高,得到大量的回交二代种子；BC2代杂种细胞染色体数目不同,从22-28条不等。对回交一代和回交二代杂种植株的黑腐病抗性鉴定结果显示：部分回交二代植株仍然保留良好的黑腐病抗性。

全文目录


摘要  9-12
ABSTRACT  12-15
缩略语  15-17
前言  17-19
文献综述  19-42
  一.远缘杂交的意义  19-20
  二.花椰菜育种及抗病种质的创制  20-35
    1.植物原生质体培养及融合研究进展  20-22
    2.原生质体非对称融合  22-25
      2.1 原生质体非对称融合的概念及特点  22-23
      2.2 影响原生质体非对称融合中染色体丢失的因素  23-25
    3.非对称体细胞杂交技术的应用  25-26
      3.1 改良细胞器基因组控制的性状,缩短育种年限  25-26
      3.2 转移植物抗逆性  26
      3.3 扩大栽培种的遗传变异  26
    4.体细胞杂种鉴定  26-29
      4.1 杂种植株的形态学鉴定  27
      4.2 杂种植株细胞学鉴定  27-28
      4.3 同功酶标记鉴定杂种植株  28
      4.4 DNA标记鉴定杂种植株  28-29
      4.5 基因组原位杂交技术(GISH)鉴定杂种植株  29
    5.体细胞杂种群体的分析  29-33
      5.1 形态学和农艺性状分析  29-30
      5.2 细胞遗传学分析  30-32
      5.3 核质及胞质基因组研究  32-33
      5.4 杂种的育性分析  33
    6.体细胞杂交在甘蓝种质创新上的应用  33-34
    7.甘蓝黑腐病抗病育种的进展  34-35
  三.远缘有性杂交创制大白菜新种质  35-42
    1.远缘有性杂交的用途  36-38
      1.1 远缘有性杂交和新物种的形成  36-37
      1.2 远缘有性杂交在育种中的应用  37-38
    2.芸薹属植物远缘有性杂交的研究  38-40
      2.1 远缘有性杂交在芸薹属中的应用  38
      2.2 远缘有性杂交育种研究中的难点  38
      2.3 实现远缘杂交可交配性的方法  38-39
      2.4 实现杂种可育的途径  39-40
    3.大白菜远缘有性杂交的利用  40
    4.白菜抗病育种及其意义  40-42
第一章 花椰菜和紫罗兰体细胞杂种的获得与鉴定  42-56
  摘要  42-43
  1.材料与方法  43-48
    1.1 植物材料及原生质体的制备  43
    1.2 仪器  43
    1.3 亲本原生质体的制备  43-44
    1.4 原生质体的融合与培养  44
    1.5 流式细胞仪测定植株相对DNA含量  44-45
    1.6 再生植株的同工酶鉴定  45
    1.7 RAPD和SRAP分子标记鉴定杂种植株  45-47
    1.8 染色体计数  47-48
  2.结果与分析  48-53
    2.1 细胞培养和植株再生  48-49
    2.2 再生植株的形态学观察  49
    2.3 再生植株的同工酶鉴定  49-50
    2.4 杂种的RAPD和SRAP分子标记鉴定  50-51
    2.5 再生植株细胞DNA含量测定及杂种染色体记数  51-53
    2.6 杂种植株的生长  53
  3.讨论  53-56
    3.1 花椰菜和紫罗兰属间体细胞融合体系的建立  53-54
    3.2 各种杂种鉴定分析方法之间的比较  54
    3.3 对称融合杂种的非对称性  54-55
    3.4 对称融合杂种植株生长势  55-56
第二章 花椰菜与黑芥体细胞杂种当代和回交后代的生物学特性分析及黑腐病抗性鉴定  56-97
  第一节 体细胞杂种当代的生物学特性分析  56-78
    摘要  56-57
    1.材料与方法  57-60
      1.1 试验材料  57
      1.2 杂种核DNA含量测定  57
      1.3 形态学性状调查  57
      1.4 花粉活力测定和结实情况调查  57
      1.5 染色体计数  57
      1.6 PMCs减数分裂行为观察  57
      1.7 SRAP分子标记  57
      1.8 茎段培养  57-58
      1.9 基因组原位杂交(GISH)分析  58-60
    2.结果与分析  60-75
      2.1 体细胞杂种的生物学特性  60-67
      2.2 可育和不育杂种的选择  67-75
    3.讨论  75-78
      3.1 体细胞杂种生物学特性与核DNA含量的关系  75
      3.2 流式细胞仪及染色体计数检测混倍体的矛盾  75-76
      3.3 体细胞杂种的育性分析  76-78
  第二节 部分体细胞杂种回交后代的生物学特性分析  78-89
    摘要  78
    1.实验材料与方法  78-80
      1.1 实验材料  78-79
      1.2 杂种核DNA含量测定  79
      1.3 形态学性状调查  79
      1.4 花粉活力测定  79-80
      1.5 染色体计数和PMCs减数分裂观察  80
      1.6 GISH分析  80
      1.7 SRAP分子标记分析  80
    2.结果与分析  80-87
      2.1 核DNA含量测定  80-82
      2.2 染色体计数  82
      2.3 BC1杂种群体的形态学分析  82-86
      2.4 花粉活力调查  86
      2.5 重点材料的GISH分析  86-87
    3.讨论  87-89
      3.1 BC1杂种群体核物质含量和组成与体细胞杂种当代的比较  87-88
      3.2 BC1杂种的花粉活力水平与育性的关系  88-89
  第三节 体细胞杂种当代及其回交后代的黑腐病抗性鉴定  89-97
    摘要  89-90
    1.实验材料与方法  90-92
      1.1 实验材料  90
      1.2 实验设计  90
      1.3 实验方法  90-92
    2.实验结果与分析  92-95
      2.1 菌种筛选  92-94
      2.2 杂种的抗病性鉴定  94-95
    3.讨论  95-97
第三章 大白菜与黑芥种间杂种及其后代的获得和分析  97-116
  摘要  97-98
  1.材料与方法  98-100
    1.1 实验材料  98
    1.2 杂交方法及杂种初筛  98-99
    1.3 子房和胚珠离体培养  99
    1.4 形态学鉴定  99
    1.5 SRAP分子标记鉴定  99
    1.6 染色体计数和减数分裂观察  99
    1.7 基因组原位杂交(GISH)分析  99
    1.8 花粉活力观察  99-100
    1.9 黑腐病抗性鉴定  100
  2.结果与分析  100-113
    2.1 F_1代杂种性质鉴定  100-103
    2.2 子房和胚珠培养获得F_1杂种回交后代  103-105
    2.3 H_1回交一代杂种的鉴定分析  105-113
  3.讨论  113-116
    3.1 F_1杂种染色体数目分析  113
    3.2 杂种育性分析  113-115
    3.3 F_1杂种及其回交后代的黑腐病抗性研究  115-116
全文讨论  116-122
  1.花椰菜和紫罗兰属间体细胞融合研究  116-117
  2.体细胞融合杂种的育性分析  117-119
  3.黑芥和花椰菜体细胞杂种及回交后代的黑腐病抗性分析  119-120
  4.黑芥×白菜的F1代及其后代的育性分析  120-122
全文结论  122-124
本论文创新之处  124-125
参考文献  125-139
附录  139-142
在读期间发表的论文情况  142-143
致谢  143

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