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三疣梭子蟹病原弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定、检测及防控研究

作　者: 梁利国
导　师: 阎斌伦
学　校: 南京师范大学
专　业: 水产养殖
关键词: 三疣梭子蟹弗氏柠檬酸杆菌组织病理药敏试验检测方法
分类号: S945
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)又称梭子蟹、枪蟹、海螃蟹,隶属甲壳纲(Crustacea),十足目(decapoda),梭子蟹科(Portunidae),梭子蟹属(Portunus),在我国主要集中于山东和江浙沿海海域,是一种食用与药用价值较高的大型海产经济蟹类。然而近年来海洋环境受到污染,生态环境不断恶化,随着梭子蟹的养殖规模的逐渐增大,各种病害开始接踵而来,并呈现大规模暴发和流行的趋势,特别是细菌性疾病,给三疣梭子蟹养殖业造成了严重的经济损失。为了进一步弄清导致养殖梭子蟹死亡的病因及其致病机理,并找到有效的检测手段和防治方法,本文以具有典型病症的病蟹作为材料,通过对病原的分离鉴定、人工回感试验、组织病理观察并结合常规的生理生化反应特性及分子生物学特性,对梭子蟹的病原进行了初步研究；同时建立了病原菌的分子生物学检测方法,筛选了防治药物,以期为梭子蟹细菌性疾病的早期诊断及防治提供科学的参考依据。2009-2010年在江苏省连云港市赣榆等地养殖的梭子蟹出现大量死亡,病蟹主要症状为蟹体消瘦,不摄食、行动缓慢,严重者浮出水面或爬在池边,对外界的刺激反应迟钝；掀开头胸甲可见肝胰腺、肌肉组织水肿,并有大量浑浊的积液,严重者肌肉糜烂并伴有腐臭的气味。从濒死的梭子蟹体内无菌操作分离得到两株优势菌。人工感染试验表明所分离的菌株JG091120-1对三疣梭子蟹、日本蟳(Charybdis japonica)、中国对虾(Penaeus chinensis)均有明显的致病作用,而另一株菌JG091120-2无致病作用,由此表明菌JG091120-1为本次梭子蟹的致病菌。通过菌体观察、培养特性及生理生化鉴定并结合系统发育学等分子手段,鉴定该菌为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)。弗氏柠檬酸杆菌隶属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)枸橼酸杆菌属(Citrobacter)。该菌革兰氏阴性,需氧或兼性厌氧,为条件致病菌,广泛分布于自然界中,是人和动物(哺乳类、鸟类、爬行类及两栖类)肠道内正常的菌群。该菌可导致河蟹、乌鳢、红螯螯虾、尼罗罗非鱼等水产动物暴发疾病。药物敏感性试验结果表明,该致病菌对氟罗沙星、头孢曲松、环丙沙星、恩诺沙星、依诺沙星、氧氟沙星、左氟沙星等7种抗生素高度敏感。运用石蜡包埋及组织切片技术对患病梭子蟹的鳃、肝胰腺、螯足肌肉、肠道、心肌等组织进行了病理学研究,同时对其致病机理进行了初步分析。其病症主要表现为：肌细胞破损、坏死,部分细胞细胞核出现萎缩或肿胀,血细胞凝集,肝胰腺细胞严重坏死。进行了病原弗氏柠檬酸杆菌防治药物的筛选工作,选择市场中常用渔用抗生素及中草药进行药敏试验,结果表明抑菌净、恩诺沙星、氟哌酸、复方磺胺甲噁唑、苏木、五倍子、五味子、大黄、黄柏、黄连等抗菌效果十分显著。本论文基于定居因子抗原cfa基因序列设计了1对引物,建立了一种弗氏柠檬酸杆菌快速、准确的PCR检测方法,敏感性检测结果显示,该PCR方法最低能检测6.47×103CFU/mL菌体浓度的弗氏柠檬酸杆菌,对其菌体模板DNA的检出极限为0.1468ng/μL；采用此方法对发病梭子蟹、中国对虾,泥蚶(Tegillarca granosa)、扇贝(Placopecta magellanicus)等海产品和养殖水体进行了检测,可从呈阳性反应的样品中分离出优势生长的弗氏柠檬酸杆菌,因此,实验所建立的基于cfa基因的PCR检测方法可用于弗氏柠檬酸杆菌引起的水产动物疾病的快速诊断。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-12
第1章绪论  12-19
  1.1 三疣梭子蟹主要病害研究进展  12-18
    1.1.1 病毒性疾病  12-13
    1.1.2 细菌性疾病  13-14
      1.1.2.1 弧菌病  13
      1.1.2.2 丝状细菌病  13
      1.1.2.3 甲壳溃疡病  13-14
      1.1.2.4 烂鳃病(或黑鳃病)  14
    1.1.3 寄生虫性疾病  14-16
      1.1.3.1 才女虫病  14
      1.1.3.2 拟阿脑虫病  14-15
      1.1.3.3 卵涡鞭虫病  15-16
      1.1.3.4 固着类纤毛虫病  16
      1.1.3.5 其他甲壳动物病  16
    1.1.4 其他疾病  16-18
      1.1.4.1 "牛奶病"  16-17
      1.1.4.2 掉腿病  17
      1.1.4.3 粘抓病  17
      1.1.4.4 水肿病  17-18
      1.1.4.5 蜕壳不遂症  18
  1.2 本论文研究的意义  18-19
第2章三疣梭子蟹病原弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定  19-34
  2.1 材料与方法  19-22
    2.1.1 病原菌的分离纯化方法  19
      2.1.1.1 材料来源  19
      2.1.1.2 细菌的分离纯化  19
    2.1.2 人工感染试验  19-20
      2.1.2.1 试验材料  19-20
      2.1.2.2 成蟹注射感染  20
      2.1.2.3 成蟹创伤浸泡感染  20
      2.1.2.4 大眼幼体、幼蟹及对虾苗浸泡感染  20
    2.1.3 细菌形态特征观察和理化特性鉴定  20-21
    2.1.4 细菌的分子鉴定  21
      2.1.4.1 PCR模板DNA制备  21
      2.1.4.2 16SrRNA基因序列的PCR扩增与测序  21
      2.1.4.3 gyrB基因序列的PCR扩增与测序  21
      2.1.4.4 16SrRNA和gyrB基因序列同源性分析及系统发育树的构建  21
    2.1.5 病原菌耐药性试验  21-22
    2.1.6 胞外酶定性分析  22
      2.1.6.1 蛋白酶活性检测  22
      2.1.6.2 脂酶活性检测  22
      2.1.6.3 卵磷脂酶活性检测  22
      2.1.6.4 淀粉酶活性检测  22
      2.1.6.5 尿素酶活性检测  22
  2.2 结果  22-32
    2.2.1 病原菌菌落形态及培养特性  22-25
    2.2.2 供试细菌的致病性  25-27
      2.2.2.1 对成蟹的致病性  25-26
      2.2.2.2 对大眼幼体及幼蟹的致病性  26-27
    2.2.3 病原菌生理生化特性  27-29
    2.2.4 16SrRNA和gyrB基因同源性分析  29-30
    2.2.5 药敏试验  30-32
  2.3 讨论  32-34
第3章梭子蟹弗氏柠檬酸杆菌病组织病理学初步研究  34-44
  3.1 材料与方法  34-35
    3.1.1 实验用蟹  34
    3.1.2 试验方法  34-35
      3.1.2.1 常规解剖观察  34
      3.1.2.2 样本组织脱水处理  34
      3.1.2.3 样本组织透明处理  34
      3.1.2.4 样本组织浸蜡处理  34
      3.1.2.5 样本组织包埋处理  34-35
      3.1.2.6 切片  35
      3.1.2.7 烤片  35
      3.1.2.8 H.E染色  35
  3.2 结果  35-42
    3.2.1 病蟹的外观及解剖症状  35-36
    3.2.2 组织病理观察  36-42
      3.2.2.1 步足肌肉组织  36-37
      3.2.2.2 螯足肌肉组织  37-38
      3.2.2.3 鳃组织  38-39
      3.2.2.4 心肌组织  39-40
      3.2.2.5 肝胰腺组织  40-41
      3.2.2.6 性腺组织  41-42
  3.3 讨论  42-44
第4章病原弗氏柠檬酸杆菌分子生物学检测方法的研究  44-50
  4.1 材料与方法  44-46
    4.1.1 试验菌株及其来源  44
    4.1.2 供试海产品  44
    4.1.3 细菌模板DNA的制备  44
    4.1.4 引物设计与合成  44-45
    4.1.5 cfa基因序列的扩增  45
    4.1.6 PCR产物检测  45
    4.1.7 PCR灵敏度检测  45
    4.1.8 PCR检测方法的应用  45-46
  4.2 结果  46-48
    4.2.1 PCR最佳反应条件的确立  46
    4.2.2 PCR特异性检测方法的建立  46
    4.2.3 PCR检测方法灵敏性检测  46-47
    4.2.4 海产品检测结果  47-48
  4.3 讨论  48-50
第5章常用中草药对三疣梭子蟹病原弗氏柠檬酸杆菌的抑、杀效果研究  50-55
  5.1 材料与方法  50-51
    5.1.1 药物及来源  50
    5.1.2 供试菌株及其来源  50
    5.1.3 中草药浓缩药液的制备  50-51
    5.1.4 菌液的制备  51
    5.1.5 抑菌作用的测定  51
    5.1.6 最小抑菌浓度的测定  51
    5.1.7 最小杀菌浓度的测定  51
  5.2 结果  51-53
    5.2.1 20种中草药煎液的抑菌效果  51-52
    5.2.2 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度  52-53
  5.3 讨论  53-55
第6章常用抗菌药物对弗氏柠檬酸杆菌的抗菌效果研究  55-63
  6.1 材料与方法  55-57
    6.1.1 实验材料用品  55-56
      6.1.1.1 营养琼脂培养基  55-56
      6.1.1.2 营养肉汤培养基  56
      6.1.1.3 抗菌药物及来源  56
      6.1.1.4 供试菌株及其来源  56
    6.1.2 菌液的制备  56
    6.1.3 抗菌药物药液的配制  56-57
    6.1.4 最小抑菌浓度的测定  57
    6.1.5 最小杀菌浓度的测定  57
  6.2 结果  57-60
    6.2.1 十种药物对弗氏柠檬酸杆菌的抗菌效果  57-60
      6.2.1.1 最小抑菌浓度  57-58
      6.2.1.2 最小杀菌浓度  58-59
      6.2.1.3 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度比较  59-60
  6.3 讨论  60-63
    6.3.1 常用抗菌药物对病原细菌杀菌效果研究的必要性  60
    6.3.2 抗菌药物的对病原细菌的研究分析  60-63
第7章结论  63-66
  7.1 研究成果小结  63
  7.2 研究展望  63-66
附录A  66-68
附录B  68-69
参考文献  69-77
致谢  77

三疣梭子蟹病原弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定、检测及防控研究

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