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利用基因组改组技术对灰黄霉素产生菌—荨麻青霉进行改良的研究

作　者: 罗剑
导　师: 杨民和
学　校: 福建师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 荨麻青霉灰黄霉素基因组改组原生质体融合育种
分类号: Q933
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

基因组改组技术是建立在原生质体融合技术基础之上的一种菌种选育新技术。灰黄霉素(griseofulvin,GF)高产菌株荨麻青霉(Penicillium urticae Bainier)发酵周期较长,增加了生产成本和生产周期。本研究拟通过基因组改组技术,以筛选出发酵周期较短或效价较高的荨麻青霉菌株。本研究的主要结果如下:(1)探索了荨麻青霉原生质体的高效制备以及再生方法:采用0.6 mol/L NaCl作为渗透压稳定剂,菌龄为28℃培养20小时,0.01 mol/L DTT预处理0.5小时,0.7%纤维素酶+0.7%蜗牛酶+0.5%溶菌酶28℃酶解3.5 h,PDA高渗双层培养基平板分离。结果表明原生质体的产量达到2.09×10~6个/ml,再生率达到21.2%;(2)通过对诱变条件的探讨确定了最佳诱变方案,对原始出发菌株的诱变采用UV与NTG复合诱变处理的方法,先用254 nm波长紫外线诱变处理150秒,再用1毫克/毫升的NTG溶液诱变处理35分钟。结果获得了形态与原始菌株不同的诱变株,经平板抑菌试验筛选出抑菌效果比出发菌株更好的3株诱变菌株,基本达到了预期的效果;(3)使用30%的PEG 4000做助融剂,在30℃下作用5分钟,通过两轮递推式原生质体融合,对融合菌株进行挑选,获得了发酵效价得到提高的3株菌株,效价提高了约15%。RAPD分析表明,改组菌株的遗传组成与原始菌株相比存在差异。初步实现了选育目的。

全文目录

摘要  2-3
ABSTRACT  3-4
中文文摘  4-9
第1章绪论  9-19
  1.1 微生物遗传育种技术的发展及历史地位  9-10
  1.2 基因组改组技术在菌种选育中的应用  10-18
    1.2.1 基因组改组技术的产生和原理  10-11
    1.2.2 基因组改组技术的方法和特点  11-13
      1.2.2.1 Genome shuffling技术的具体方法  11
      1.2.2.2 Genome shuffling的特点  11-12
      1.2.2.3 Genome shuffling育种优势的验证  12-13
    1.2.3 基因组改组技术的应用  13-17
      1.2.3.1 用于改进微生物代谢产物产量  14
      1.2.3.2 用于改进微生物多基因调控表型的进化和对环境的适应性  14-15
      1.2.3.3 用于提高微生物菌株的遗传多样性  15-16
      1.2.3.4 与其他生物技术相结合大幅改进微生物性状  16
      1.2.3.5 基因组改组技术应用面临的难点  16-17
    1.2.4 基因组改组技术的展望  17-18
      1.2.4.1 基因组改组技术与基因工程技术手段相结合的展望  17
      1.2.4.2 基因组改组技术应用于代谢工程的展望  17-18
  1.3 本课题的研究内容及目的意义  18-19
第2章荨麻青霉原生质体的制备与再生  19-35
  2.1 材料和方法  19-21
    2.1.1 菌株  19
    2.1.2 培养基  19
    2.1.3 工具酶及酶液配制  19-20
    2.1.4 其它试剂  20
    2.1.5 仪器及设备  20
    2.1.6 原生质体的制备和分离  20
    2.1.7 原生质体的再生  20-21
  2.2 原生质体制备与再生条件的探索  21-29
    2.2.1 酶系和酶浓度的选择  21-25
      2.2.1.1 单一酶液对原生质体形成的影响  21-23
      2.2.1.2 混合酶浓度对原生质体形成率和再生率的影响  23-25
    2.2.2 菌龄对原生质体形成率的影响  25
    2.2.3 酶解时间对原生质体形成率的影响  25-26
    2.2.4 酶解温度对原生质体形成率和再生率的影响  26
    2.2.5 渗透压稳定剂对原生质体形成率和再生率的影响  26-27
    2.2.6 不同再生培养基对原生质体再生的影响  27-28
    2.2.7 预处理剂DTT对原生质体形成率和再生率的影响  28-29
  2.3 荨麻青霉原生质体的形态观察  29-31
  2.4 荨麻青霉原生质体再生的观察  31
  2.5 讨论  31-35
第3章荨麻青霉的基因组改组  35-63
  3.1 荨麻青霉原始菌株的诱变  35-40
    3.1.1 材料与方法  35-38
      3.1.1.1 菌株  35
      3.1.1.2 培养基  35
      3.1.1.3 药品与试剂  35
      3.1.1.4 诱变用具及型号或使用要求  35-36
      3.1.1.5 出发菌株的培养  36
      3.1.1.6 制备菌悬液  36
      3.1.1.7 紫外线处理  36
      3.1.1.8 NTG处理  36-37
      3.1.1.9 离心洗涤  37
      3.1.1.10 稀释涂皿  37-38
      3.1.1.11 培养  38
      3.1.1.12 筛选  38
    3.1.2 结果  38-39
    3.1.3 讨论  39-40
  3.2 荨麻青霉多亲本的融合  40-46
    3.2.1 材料及方法  40-43
      3.2.1.1 实验菌株  40-41
      3.2.1.2 培养基  41
      3.2.1.3 仪器  41
      3.2.1.4 多亲本融合的菌株的确定  41
      3.2.1.5 荨麻青霉第一轮多亲本融合  41-43
        3.2.1.5.1 原生质体的制备  41-42
        3.2.1.5.2 原生质体融合  42
        3.2.1.5.3 原生质体再生  42-43
      3.2.1.6 荨麻青霉第二轮多亲本融合  43
    3.2.2 结果  43-44
      3.2.2.1 用于融合的出发菌株的抑菌结果  43
      3.2.2.2 多亲本融合结果  43-44
    3.2.3 小结与讨论  44-46
  3.3 荨麻青霉多亲本融合后代的筛选  46-55
    3.3.1 材料和方法  46-48
      3.3.1.1 菌株  46
      3.3.1.2 实验药品  46
      3.3.1.3 筛选方法  46
      3.3.1.4 灰黄霉素标准曲线的绘制  46-48
      3.3.1.5 发酵液效价的测定方法  48
    3.3.3 筛选结果  48-53
      3.3.3.1 融合菌株的形态特征  48-51
      3.3.3.2 基因组改组后菌株的发酵情况比较  51-53
    3.3.4 小结与讨论  53-55
  3.4 多亲本融合菌株的RAPD鉴定  55-63
    3.4.1 材料与方法  56-58
      3.4.1.1 菌株  56
      3.4.1.2 仪器与试剂  56
      3.4.1.3 基因组DNA提取  56-57
      3.4.1.4 RAPD扩增试验  57-58
      3.4.1.5 数据统计与分析  58
    3.4.2 结果  58-61
      3.4.2.1 RAPD多态性分析  58-60
      3.4.2.2 荨麻青霉7个菌株RAPD聚类分析  60-61
        3.4.2.2.1 RAPD聚类分析  60
        3.4.2.2.2 各个菌株间亲缘关系聚类图  60-61
    3.4.3 小结和讨论  61-63
第4章结论和讨论  63-65
  4.1 结论  63-64
  4.2 讨论  64-65
参考文献  65-71
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  71-73
致谢  73-75

利用基因组改组技术对灰黄霉素产生菌—荨麻青霉进行改良的研究

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