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用四种体外试验方法评价长春新硷诱发的人淋巴细胞的遗传损伤

作　者: 姜薇
导　师: 陈士杰；何继亮
学　校: 浙江大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 彗星试验微核试验 hprt基因突变 TCR基因突变长春新硷
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

1．目的抗肿瘤药物是通过杀死增生细胞和破坏细胞分裂来阻止肿瘤生长的化学物，然而，许多抗肿瘤药物在动物实验和体外实验证明具有致癌性、致突变性和致畸性。目前检测细胞遗传损伤的方法很多，常用的有染色体畸变、姐妹染色单体交换（SCE）、微核试验（MN）、彗星试验和基因突变试验等方法。长春新硷（VCR）是一种抗有丝分裂的抗肿瘤药物，并被IARC列为10种对人致癌的抗癌药物中的一种（IARC，1987，1990）。长春新硷系纺锤体毒物，能影响有丝分裂和减数分裂，诱发染色体多倍体、染色体畸变和微核，而且低剂量VCR还具有致畸作用。为了研究VCR引起遗传损伤的特点，本实验通过4个体外试验即胞质分裂阻断微核试验（染色体损伤）、hprt基因突变试验和TCR基因突变试验（基因突变）和彗星试验（DNA损伤）从不同遗传终点来评价人外周血淋巴细胞暴露于不同剂量长春新硷（VCR）后所诱发的遗传损伤。2．材料与方法2．1样本肝素化的外周血采自男女两名，25岁，无有毒有害物质职业接触史健康的助血员。样本VCR暴露最终浓度为0．00、0．01、0．02、0．04、0．08μg ml^-1，暴露24h后用PBS清洗两次。2．2方法彗星试验：分离淋巴细胞，调整细胞密度并用台盼蓝染色计数细胞存活率，经制片、细胞裂解、电泳、中和、染色等步骤后在荧光显微镜（OLYMPUS-BX51）下观察。测量彗星图像指标是彗星尾长和尾相。胞质分裂阻断微核试验：将全血于1640培养基中37℃培养44h，加入细胞松弛素B，继续培养28h后收获细胞，经离心、低渗、固定、制片、自然干燥后吉姆塞染色。高倍镜下计数1000个双核细胞，以微核率（MNR）、微核细胞率（MCR）、核芽（Buds）、核质桥（NPBs）、和凋亡细胞（apoptotic cells）作为细胞毒性和染色体损伤指标。另计数500个细胞，计算核分裂指数（NDI）。hprt基因突变试验：基本方法与微核实验同。其中一份培养基加入0．2mM的6-巯基鸟嘌呤（Sigma）。37℃,叵温箱中培养72h。制片后在400倍光学显微镜下观测同一胞浆内具有完整核膜的相压、相切或分离的双核或多核的淋巴细胞数，计算hprt基因突变率。TCR基因突变试验：分离淋巴细胞，用台盼蓝试验检测细胞存活率并计数细胞数目。加入抗人CD4-fluorescein isothiocyanate（FITC）和CD3-phycoerythrin（PE）单克隆抗体（BD Biosciences），避光冰上孵育30分钟。TCR突变CD3^-CD4⁺T细胞通过流式细胞仪检测，计算TCR基因突变率。3．结果实验结果表明可用彗星试验，微核试验，hprt基因突变试验和TCR基因突变试验四个体外试验检测出长春新硷诱导的人淋巴细胞的遗传损伤。（1）彗星试验助血员1：染毒剂量从0．01μg ml^-1到0．08μg ml^-1时，助血员1的平均尾长（MTL）和尾相（MTM）分别从1．87±0．09μm和0．77±0．04增至4．44±0．28μm和2．22±0．21，与对照组的1．14±0．03μm和0．51±0．01相比较，差异明显（P<0．05或P<0．01）。助血员2：染毒剂量从0．01μg ml^-1到0．08μg ml^-1时，助血员2的平均尾长（MTL）和尾相（MTM）分别从1．76±0．07μm和0．65±0．03增至4．05±0．18μm和1．86±0．10，与对照组的1．08±0．04μm和0．49±0．02相比较，差异明显（P<0．05或P<0．01）。（2）微核试验助血员1的结果发现，染毒剂量从0．01μg ml^-1到0．08μg ml^-1时，微核率、微核细胞率、核芽、核质桥和核分裂指数（减少）分别从16．00±2．52、13．00±1．00、6．33±0．33、1．33±0．33、1．82±0．04增加（减少）到67．00±1．15、47．33±3．53、14．00±1．53、4．67±0．43、1．44±0．02，与对照组的2．00±0．58、2．00±0．58、0．00±0．0、00．00±0．00、2．34±0．01相比，有明显差异（P<0．05或P<0．01）。染毒剂量从0．01μg ml^-1到0．08μg ml^-1时，凋亡细胞数从0．67±0．33增至17．33±1．20。染毒剂量0．02μg ml^-1时，凋亡细胞数为2．67±0．67，从该剂量开始与对照组相比出现明显差异（P<0．05或P<0．01）。助血员2的结果发现，染毒剂量从0．01μg ml^-1到0．08μg ml^-1时，微核率、微核细胞率、核芽、核质桥和核分裂指数（减少）分别从19．00±2．65、17．00±2．08、5．33±0．33、1．67±0．67、1．83±0．05增加（减少）到74．67±1．33、60．00±0．58、17．00±1．53、5．00±0．58、1．44±0．02，与对照组的6．00±1．53、5．67±1．20、1．67±0．33、0．00±0．00、0．00±0．00、2．27±0．01相比，有明显差异（P<0．05或P<0．01）。染毒剂量从0．01μg ml^-1到0．08μg ml^-1时，凋亡细胞数从0．33±0．33增至12．67±0．88。染毒剂量0．02μgml^-1时，凋亡细胞数为3．33±0．33，从该剂量开始与对照组相比出现明显差异（P<0．05或P<0．01）。（3）hprt基因突变试验结果：当染毒剂量从0．01μg ml^-1到0．08μg ml^-1时，助血员1 Mf-hprt从0．96±0．03‰增至1．44±0．08‰，并从0．02μg ml^-1剂量组（1．01±0．04）开始与对照组（0．85±0．02）相比出现明显差异（P<0．05或P<0．01）。助血员2组当染毒剂量从0．01μg ml^-1到0．08μg ml^-1时，Mf-hprt从0．96±0．02‰增至1．47±0．12‰，并从0．02μg ml^-1剂量组（1．01±0．04）开始与对照组（0．85±0．02）相比出现明显差异（P<0．05或P<0．01）。（4）在TCR基因突变试验中，当染毒剂量从0．01μg ml^-1到0．08μg ml^-1时，助血员1 Mf-TCR从2．65±0．34×10^-4增至7．68±1．13×10^-4，并从0．04μg ml^-1剂量组(5．78±0．67×10^-4)开始与对照组(1．97±0．12×10^-4)相比出现明显差异（P<0．01）。助血员2组当染毒剂量从0．01μg ml^-1到0．08μg ml^-1时，Mf-TCR从3．6±0．65×10^-4增至6．51±0．30×10^-4，并从0．02μg ml^-1剂量组(4．15±0．67×10^-4)开始与对照组(2．46±0．41×10^-4)相比出现明显差异（P<0．05或P<0．01）。4．结论4个体外实验证实VCR在多个遗传终点均可检测出对人淋巴细胞的遗传损伤效应。5．创新点5．1采用多个体外试验从多个遗传终点来评价VCR的遗传毒性。5．2采用微核试验的多个指标，研究引起遗传损伤的特点。5．3未见采用基因突变体外实验方法研究VCR对细胞的遗传损伤效应。

全文目录

致谢  5-7
缩略语  7-8
中文摘要  8-12
英文摘要  12-17
引言  17-20
材料与方法  20-32
实验结果  32-48
讨论  48-54
结论  54-55
参考文献  55-62
文献综述  62-70
在读期间发表的论文和所获奖励  70

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