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香蕉枯萎病菌FPD1基因的克隆、表达及其生防菌分离、筛选

作　者: 唐复润
导　师: 黄俊生
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 香蕉枯萎病 尖镰孢古巴专化型 致病基因FPD1表达 生防放线菌
分类号: S436.68
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 296次
引　用: 5次
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内容摘要


香蕉枯萎病是一种系统性维管束病害,分布于世界各地,能对香蕉产业造成毁灭性打击,其病原菌为尖镰孢古巴专化型[Fusarium oxysporum f .sp.cubense (E.F.Smith) snyder et Hansen],隶属半知菌亚门、丝孢纲、瘤痊菌目、镰刀菌属。本研究以香蕉枯萎病原菌生理小种1号、生理小种4号为材料,通过对尖镰孢番茄专化型致病相关基因FPD1的分析,运用同源基因克隆方法,分别从生理小种1号、生理小种4号克隆了致病相关基因FPD1:生理小种1号FPD1基因全长989 bp,含有一个内含子,为47 bp,编码序列长度为942 bp;生理小种4号FPD1基因全长1013 bp,含有一个内含子,为47 bp,编码序列长度为966 bp。运用DNAStar5.0进行了核苷酸序列比对,4号生理小种比1号生理小种多24bp核苷酸,有31个核苷酸位点不同,同源性为99.3%。对生理小种4号FPD1片段,共615 bp,克隆到原核表达载体pET-32a,并将表达表达载体pET-32a-FPD1转化表达宿主菌BL21(DE3),宿主菌经IPTG诱导,通过SDS-PAGE电泳分析,在46KD左右的位置检测到了特异的蛋白质条带,结果表明构建的FPD1片段得到原核表达,将表达的FPD1融合蛋白切胶回收,研磨成粉后加入等体积的福氏不完全佐剂,乳化制备成抗原。免疫家兔四次后,采血收集抗血清,制备了兔抗FPD1多克隆抗体,经过ELISA检测,抗血清的效价达1:10000。本研究还利用改良高氏培养基,分离、筛选获得一株放线菌,命名为:JFA-001。抑菌活性测定结果表明:该菌对香蕉枯萎病菌生理小种1号、生理小种4号病原真菌表现出较强的抑菌活性。分子生物学分类鉴定结果表明:JFA-001菌株同Streptomyce albogriseus的16S rDNA扩增序列同源性达99.7%。

全文目录


中文摘要  3-4
英文摘要  4-9
1 前言  9-21
  1.1 香蕉枯萎病研究概况  9-16
    1.1.1 香蕉概况  9-10
    1.1.2 病原菌的生物学特征  10-12
      1.1.2.1 病原菌特征  10-11
      1.1.2.2 病原菌的侵染和发病  11
      1.1.2.3 病害症状  11-12
      1.1.2.4 生理小种  12
    1.1.3 香蕉枯萎病营养亲和群  12-13
    1.1.4 香蕉枯萎病菌 DNA 多态性  13-14
      1.1.4.1 尖孢镰菌遗传多态性分析技术  13
      1.1.4.2 DNA 多态性与病菌 VCG 的关系  13-14
    1.1.5 香蕉枯萎病害防治  14-15
      1.1.5.1 抗病育种  14
      1.1.5.2 生物防治  14-15
      1.1.5.3 药剂防治  15
    1.1.6 病原菌的检测技术  15-16
      1.1.6.1 致病性测定  15
      1.1.6.2 PCR 检测  15-16
  1.2 病原菌侵染机制  16-17
  1.3 植物病原菌致病相关基因研究进展  17-19
    1.3.1 植物病原菌基因克隆常用的方法  17-18
      1.3.1.1 差异杂交克隆法  17
      1.3.1.2 功能互补克隆法  17
      1.3.1.3 根据蛋白质克隆基因法  17
      1.3.1.4 染色体步查克隆法（chromosome walking）  17-18
      1.3.1.5 转座子标签法  18
    1.3.2 枯萎病菌致病相关基因的克隆  18-19
  1.4 本研究的目的和意义  19-21
2 材料与方法  21-40
  2.1 试验材料  21-23
    2.1.1 病原菌  21
    2.1.2 主要培养基  21
    2.1.3 主要试剂、酶和缓冲液  21-22
    2.1.4 主要仪器设备  22
    2.1.5 引物合成与 DNA 测序  22
    2.1.6 聚丙烯酰胺储液  22
    2.1.7 1.0 M Tris-Cl (pH 6.8)  22
    2.1.8 1.5 M Tris-Cl (pH 8.8)  22-23
    2.1.9 2×凝胶加样缓冲液的配制  23
    2.1.10 5×Tris–甘氨酸电泳缓冲液的配制  23
    2.1.11 考马斯亮蓝 R-250 染色液  23
    2.1.12 考马斯亮蓝脱色液  23
  2.2 实验方法  23-40
    2.2.1 香蕉枯萎病病原菌 DNA 的提取  23-24
    2.2.2 香蕉枯萎病病原菌总 RNA 的提取  24-25
    2.2.3 FPD1 基因的克隆  25-31
      2.2.3.1 引物设计与合成  25
      2.2.3.2 cDNA 的合成  25-26
      2.2.3.3 基因组 DNA 的 PCR 扩增  26
      2.2.3.4 cDNA 的 RT-PCR 扩增  26-27
      2.2.3.5 PCR 产物的回收  27
      2.2.3.6 宿主菌 E.coli XL1 感受态的制备  27-28
      2.2.3.7 回收产物的连接与转化  28-31
        2.2.3.7.1 连接  28-29
        2.2.3.7.2 转化  29
        2.2.3.7.3 质粒 DNA 的提取及重组质粒的酶切鉴定  29-31
          2.2.3.7.3.1 碱裂解法少量提取质粒  29-30
          2.2.3.7.3.2 重组质粒的酶切鉴定  30-31
        2.2.3.7.4 DNA 序列测定和分析  31
    2.2.4 FPD1 片段的原核表达  31-36
      2.2.4.1 原核表达载体的构建  31-33
        2.2.4.1.1 表达载体线性化  31-32
        2.2.4.1.2 FPD1 片段 PCR 扩增  32
        2.2.4.1.3 FPD1 片断的制备  32-33
      2.2.4.2 FPD1 片段与线性化载体pET32a 的连接  33
      2.2.4.3 连接产物的转化  33
        2.2.4.3.1 感受态 E.coli XL1 的制备  33
        2.2.4.3.2 转化  33
      2.2.4.4 重组子的筛选与鉴定  33-34
        2.2.4.4.1 碱裂解法少量提取质粒  33
        2.2.4.4.2 重组子酶切鉴定  33-34
      2.2.4.5 pET-32a-FPD1 转化宿主菌 BL21(DE3)  34-36
        2.2.4.5.1 质粒鉴定  34
        2.2.4.5.2 诱导表达与检测  34-36
          2.2.4.5.2.1 表达产物的制备  34-35
          2.2.4.5.2.2 表达产物的 SDS-PAGE 电泳  35
          2.2.4.5.2.3 聚丙烯酰胺凝胶的制备  35
          2.2.4.5.2.4 上样与电泳  35-36
          2.2.4.5.2.5 染色与脱色  36
    2.2.5 抗血清的制备与效价测定  36-38
      2.2.5.1 抗原的制备  36
      2.2.5.2 免疫程序  36-37
      2.2.5.3 血液处理及保存  37
      2.2.5.4 抗血清效价测定  37-38
    2.2.6 放线菌的分离鉴定  38-40
      2.2.6.1 土壤采集  38
      2.2.6.2 放线菌的分离  38
      2.2.6.3 抗菌活性测定  38
      2.2.6.4 形态观察  38-39
      2.2.6.5 16S rDNA 的 PCR 扩增和序列分析  39
      2.2.6.6 系统发育分析  39-40
3 结果与分析  40-55
  3.1 香蕉枯萎病病原菌的总 DNA 的提取  40
  3.2 香蕉枯萎病病原菌 RNA 的提取  40-41
  3.3 FPD1 基因的基因组 DNA 和cDNA 的 PCR 扩增  41
  3.4 pMD18-T-FPD1F1 和pMD18-T-FPD1F4 鉴定  41-42
  3.5 序列分析比对  42-49
    3.5.1 生理小种1 号 FPD1 基因序列分析  42-44
    3.5.2 生理小种4 号 FPD1 基因序列分析  44-46
    3.5.3 同源性分析  46-49
  3.6 FPD1 片段 PCR 扩增  49
  3.7 表达载体的构建  49-50
  3.8 工程菌株 BL21（DE3）/pET-32a-FPD1 的鉴定  50-51
  3.9 目的片段的诱导表达  51-52
  3.10 抗血清制备及效价测定  52-53
    3.10.1 抗血清制备  52
    3.10.2 抗血清效价测定  52-53
  3.11 放线菌 JFA-001 抗菌活性  53
  3.12 放线菌 JFA-001 菌株形态特征  53-54
  3.13 16S rDNA 的序列分析  54-55
4 讨论  55-58
  4.1 FPD1 基因克隆  55
  4.2 FPD1 片段的表达  55-56
  4.3 制备多克隆抗体  56
  4.4 生防放线菌筛选  56-58
5 结论  58-59
参考文献  59-66
致谢  66

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 果树病虫害 > 多年生草本果类病虫害
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