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腹腔气雾化疗减少裸鼠腹膜癌种植的实验研究

作　者: 闫鸿涛
导　师: 李国新
学　校: 第一军医大学
专　业: 普通外科学
关键词: 气雾化疗腹膜种植胃肠肿瘤游离癌细胞
分类号: R735.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

胃肠道恶性肿瘤是我国发病率及死亡率均较高的恶性肿瘤，目前治疗主要以手术为主，但术后仍有约50％左右患者出现局部复发或转移，成为影响长期生存的直接因素。腹腔内游离癌细胞（free cancer cell，FCC）和不能完全手术切除的微小癌灶的存在是造成肿瘤复发转移的主要原因之一。怎样清除术后腹腔内游离癌细胞和腹腔内的微小癌灶已成为降低进展期胃肠道癌术后腹腔复发率，提高胃肠道肿瘤术后远期疗效的关键。国内外学者为探索胃肠癌的综合治疗方法进行了不懈努力，包括术前的动脉灌注化疗、术中肠腔内化疗、术前放疗化疗结合、围手术期的辅助化疗等，但对腹腔种植的疗效均不令人满意。近年来，腹腔内区域性化疗因其独特的药代动力学特征及其他基础特点而备受重视。研究表明，腹腔化疗具有药代动力学优势，可以有效的预防和治疗胃结肠癌术后腹膜及肝脏的复发。抗肿瘤作用的强弱与肿瘤瘤灶周围的抗肿瘤药物的浓度成正比，腹腔内给药后其代谢途径主要是经门静脉循环系统进入肝脏，由肝脏代谢成低毒形式，只有很少一部分通过腹膜廓清直接进入体循环，与静脉化疗全身廓清相比，由于“腹腔—血浆屏障”作用，腹腔内化疗药物浓度可以为血管内给药浓度的数倍乃至数十倍，在腹腔内提供了恒定持久高浓度的抗癌药，使腹腔内游离癌细胞和微小癌灶直接浸泡在高浓度的抗癌药液中，从而大大加强了抗肿瘤药物的作用。自Jacob等最早报道了应用腹腔镜行结直肠手术，1994年日本的Kitano等首次报道了腹腔镜胃癌手术以来，由于术后疼痛轻、胃肠功能恢复快及对机体免疫功能影响小等微创优点明显，腹腔镜技术在胃肠外科逐渐得到了广泛的应用。但是腹腔镜手术需要建立气腹以显露术野，术中气腹的影响可能使FCC播散种植的危险增大，气腹的涡流作用可能将腹腔脱落的癌细胞播散开来，从而造成腹膜种植转移，严重影响治疗效果。如何有效杀灭这些脱落的腹腔游离癌细胞已成为困挠腹腔镜胃肠道肿瘤外科的难题。在腹腔镜胃肠肿瘤手术过程中，能否利用气腹这一技术特点，将抗癌药物雾化后随气腹导入腹腔，达到抑制FCC种植的效果?为回答这一问题，本实验采用人结肠癌LoVo细胞裸鼠种植模型，实施5—FU气雾化疗，初步观察其疗效。目的1、研制可与人工气腹机相连接的气雾化疗仪，该仪器可控制单位时间内注入化疗药物的量，并且不改变化疗药物的化学性质。2、观察5—FU腹腔气雾化疗对裸鼠腹腔游离癌细胞腹膜种植的影响。方法1、气雾化疗仪的研制与第一军医大学南方医院器材科工程师合作，共同研制可与人工气腹机相连接的气雾化疗仪，根据拟采用化疗药物（5-氟尿嘧啶）的分子量，调整超声波频率，在不破坏药物化学性质的情况下，将化疗药物随CO₂气腹建立的同时雾化成气体注入裸鼠腹腔，并控制单位时间内注入化疗药物的量。2、实验动物及分组Balb／C（nu／nu）裸小鼠由第一军医大学南方医院实验动物中心提供，4～6周龄，体重17～20g，共60只，雌雄兼有。实验裸鼠及实验条件达到无特殊病原菌（specific-pathogen-free，SPF）级标准。将实验裸鼠随机分为二组：腹腔气雾化疗组和对照组。每组各30只。3、人结肠癌（LoVo）细胞株细胞悬液配制人结肠癌（LoVo）细胞在37℃，培养液为含10％热灭活小牛血清、青霉素100U／mL和链霉素100U／mL的RPMI-1640培养基，5％CO₂饱和湿度的孵育箱中培养，48h换液一次。体外培养的细胞处于对数生长期生长密集时，用2.5g／L胰蛋白酶消化1～2min，倾出消化液，加入无血清RPMl1640洗涤，用机械吹打法取出细胞，2000r／min离心10min，用无血清RPMl1640配成1×10¹⁰／L接种细胞浓度，用相差显微镜观察呈均匀的单细胞悬液，以苔盼蓝（trypan blue）染色检测细胞活力＞99％。4、人结肠癌LoVo细胞裸鼠腹腔种植模型的制备用75％的酒精消毒裸鼠腹部皮肤，取1mL注射器，4.5号针头抽吸已制备的细胞悬液0.5mL（含5×10⁶瘤细胞），于右下腹穿刺入腹，缓慢注入后迅速拔针，用酒精棉球稍按压进针处皮肤。5、腹腔气雾化疗无菌条件下，腹腔内注射1％戊巴比妥钠（用药量0.05mg／g体重）麻醉裸鼠，固定于特制的鼠台上。麻醉成功后，使用自制气腹装置于裸鼠左上腹穿刺7号气腹针模拟腹腔镜手术建立人工气腹，观察腹壁均匀膨隆后，右下腹插入一根4号穿刺针模拟腹腔镜穿刺trocar，用来调整出口气体流速，维持气腹压约8mmHg,气雾化疗仪与气腹机管道相连通，同时进行气雾化疗。气雾化疗组：将氟尿嘧啶（20mg／kg）用生理盐水稀释成20ml，随CO₂气体同时进入腹腔。对照组：生理盐水20ml，随CO₂气体同时进入腹腔。灌注时间均为30min，在雾化过程中注意调整出入管通畅，灌注结束后尽量使腹腔内的气体排净、液体流出。6、观察指标：①致瘤率。②体重变化。③有无腹水。④病理学检查：把处死的裸鼠解剖，将肉眼观察可疑及明确出现转移的肝脏、脾脏、腹膜等组织采集，10％甲醛固定，石蜡包埋，切片后苏木精一伊红染色（HE）染色，光镜观察。7、统计学方法数据采用SPSS13.0软件包分析，计量资料以（?）±s表示，两组均数比较采用t检验，体重变化作重复测量方差分析，计数资料采用列联表X²检验，P＜0.05为差异显著标准。结果1、致瘤率：气雾化疗组为36.7％（11／30），对照组为100％（30／30）。两组相比，X²=27.805，P=0.000，差异有显著性意义。2、体重变化：开始实验时及实验后第2周称重时，实验组小鼠体重与对照组小鼠相比无显著性差异。此后对照组小鼠体重增长速度较实验组显著增加，实验后第4周时实验组小鼠体重显著低于对照组小鼠体重（P=0.013），至第6周称重时二组小鼠体重比较仍有显著性差异（P=0.000）。3、腹水情况：实验6周时部分裸鼠明显可见有腹水。打开腹腔，两组中致瘤裸鼠腹腔内均可见不等量血性腹水（约2-5ml）。出现腹水的时间早晚和腹水的量多少相对应。4、病理结果：肿瘤结节主要分散生长于肠道浆膜面，腹壁上，大小不等，质较硬，灰白色，剖面呈鱼肉样，部分较大瘤体中央出现坏死区。部分实验鼠在腹膜、肠系膜、肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏等处也可见肿瘤结节。光镜下可见肿瘤为低分化腺癌，由大量浸润性生长的癌组织构成。多排列呈巢状，偶见腺管样结构。癌细胞大小不等，异型性明显，多见核分裂像。结论5—FU腹腔气雾化疗可减少裸鼠腹腔LoVo细胞种植致瘤，可能成为防治腹腔镜大肠癌手术中FCC种植转移的新思路。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-13
前言  13-16
气雾化疗对游离癌细胞腹膜种植的影响  16-42
  材料和方法  16-23
  结果  23-28
  讨论  28-35
  全文小结  35-36
  参考文献  36-42
综述腹腔镜在大肠癌手术中的应用  42-48
缩略词表  48-49
成果  49-50
致谢  50-52

腹腔气雾化疗减少裸鼠腹膜癌种植的实验研究

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