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共振光散射技术在核酸分析中的研究及其应用

作　者: 廖栩泓
导　师: 陈展光
学　校: 汕头大学
专　业: 工业催化
关键词: 共振光散射(RLS) 核酸甲基紫6B 维多利亚蓝B 偶氮胭脂红G 十二烷基二甲基甜菜碱(BS-12) Mn(Ⅱ) 表面活性剂
分类号: O657.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

核酸是最基本的生命物质之一，在生命活动中扮演着重要的角色。存储遗传信息以及合成蛋白质是核酸的最重要的功能。在过去的一个世纪里，人类对核酸的研究取得了许多突破性的进展，核酸的研究领域也得到了拓展。对于核酸的研究逐渐成为生命科学中的活跃领域，而核酸的定量测定在基础研究和临床诊断中具有重要意义。目前，对核酸的定量分析主要有三种方法：1、分光光度法。其中包括基于磷含量的光度分析法、基于糖含量的光度分析法和基于碱基的紫外吸收光度分析法；2、荧光分析法。该方法基于各种插入核酸分子的染料的荧光增强(或淬灭)；3、共振光散射技术。已证明，在生物模板上进行长距组装的试剂能够产生增强的共振光散射信号。基于这些信号，建立了灵敏的核酸测定方法。现用于共振光散射法测定核酸的试剂主要有卟啉类化合物、金属螯合物和有机小分子染料三类。以上提到的三种方法中，光度分析法大都繁琐、耗时长，而且灵敏度不高。尽管荧光法有着出色的选择性和灵敏度，但存在着荧光试剂价格昂贵、有毒性等缺陷。共振光散射法作为一种新兴的技术，具有简便、快速、灵敏度高、选择性高等特点，但是在分析化学研究的应用和研究中还有很多不足，其理论，尤其是成因方面还存在较多的争论，需要做大量工作来进一步完善。小分子与核酸的作用主要有两种方式：共价作用(不可逆相互作用)和非共价作用(可逆相互作用)。非共价作用又包括三种形式：一种是染料嵌入核酸的碱基，称之为嵌入结合；一种是染料结合在核酸的大沟或小沟上，称之为沟区结合；还有一种是染料由于静电作用和疏水作用而在核酸分子表面进行的长距组装。而最后一种形式是共振光散射法测定核酸时共振光散射探针与核酸作用的主要作用机理。本论文在查阅大量文献的基础上，结合现有的实验条件，采用新兴的共振光散射技术建立了几种新的核酸测定方法。这些方法具有简便、快速、重现性选择性好、线性范围宽等特点。本论文分为五章。第一章，甲基紫6B-核酸共振光散射体系的研究与应用首次将碱性三苯甲烷类染料甲基紫6B用于核酸的共振光散射测定。在pH 10.80的缓冲液中，核酸的加入导致甲基紫6B在386nm处共振光散射的增强，其增强强度与汕头大学工学硕士学位论文核酸的浓度呈线性关系，据此建立了一种测定核酸的共振光散射法。fsDNA与y洲A的线性范围分别为0.083一1 .0和0.075一0.8 pg/mL，检出限分别为82.6和74.3 ng/mL。第二章，维多利亚蓝B一核酸共振光散射体系研究与应用在pH6、7一6.9范围内，维多利亚蓝B(vBB)与核酸作用只产生微弱的共振光散射增强。阳离子染料和表面活性剂以核酸为模板，在其分子表面上发生聚集，形成离子缔合物。在缔合物形成过程中，核酸拉近了阳离子染料与表面活性剂之间的距离，形成了大的聚集体，从而增强了体系中阳离子染料的共振光散射强度。共振散射光增强的程度与核酸浓度在一定范围有线性关系，据此建立一种测定核酸的共振光散射法。小牛胸腺DNA、鱼精子DNA的线性范围均为0.05一2.0协g/mL，酵母RNA的线性范围为0.02一1 .5协g/mL，检出限分别是5.61，7.22，3.03 ng/mL。第三章，偶氮胭脂红G一DNA共振光散射体系研究与应用研究了偶氮类酸性染料偶氮胭脂红G在阳离子表面活性剂CTMAB存在下与DNA的共振光散射光谱。在pH 9.0条件下，cTMAB首先在DNA表面上发生聚集，形成带正电荷的预胶束，促使带负电荷的AG在表面活性剂的预胶束上聚集，从而形成了DNA一CTMAB一AG三元离子缔合物聚集体。在三元离子缔合物的形成过程中，CTMAB起到了中介的作用，拉近了DNA与染料之间的距离，增强了它们之间的相互作用。共振光散射的增强程度与DNA的浓度在一定范围内呈线性关系，据此建立了一种新的测定DNA的共振光散射法。fsDNA与。tDNA的线性范围分别为0.03一1 .5和0一1 .5协留mL，检出限分别为2.8和2.on留mL。与其它测定核酸的共振光散射方法相比，该方法的测定波长红移，可有效降低背景干扰，增强共振光散射信号。第四章，两性离子表面活性剂BS一12与DNA共振散射体系的研究与应用鉴于目前已有的作为核酸共振光散射探针的表面活性剂多采用阳离子表面活性剂，本章首次研究了两性离子表面活性剂十二烷基二甲基甜菜碱(BS一12)与DNA的共振光散射光谱，发现在pH 9.3的缓冲液中，DNA与Bs一12在388lun处有共振光散射增强，其强度与核酸的浓度呈线性关系，据此建立了一种测定DNA的共振光散射法。该方法具有操作简单，线性范围宽，检出限低的特点。fsDNA与。tDNA的线性范围分别为0.02一12和0.02一12卜g/mL，检出限分别为1 .5和l.6ng/mL。第五章，Mn离子与核酸共振光散射的研究与应用金属离子没有生色基团，在共振光散射法中主要体现金属离子与生物大分子结合粒中文摘要子的大小对肚s信号的影响。本章研究表明，在酸性条件下，DNA与MnZ+结合时能产生增强的共振光散射，其最大散射峰位于386.0nln处，RLS信号强度与DNA浓度呈线性关系，据此建立了用共振光散射测量痕量DNA的新方法。ctDNA，fsDNA，y洲A?

全文目录

中文摘要  3-6
英文摘要  6-10
引言  10-18
第一章甲基紫6B-核酸共振光散射体系的研究与应用  18-24
  第一节实验部分  18-19
  第二节结果与讨论  19-23
  第三节合成样品分析  23-24
第二章维多利亚蓝B-核酸共振光散射体系的研究与应用  24-31
  第一节实验部分  24-25
  第二节结果与讨论  25-29
  第三节合成样品分析  29
  第四节前两章小结  29-31
第三章偶氮胭脂红G-DNA共振光散射体系的研究与应用  31-37
  第一节实验部分  31-32
  第二节结果与讨论  32-36
  第三节合成样品分析  36-37
第四章两性离子表面活性剂BS-12与DNA共振散射体系的研究与应用  37-43
  第一节实验部分  37-38
  第二节结果与讨论  38-42
  第三节合成样品中DNA的测定  42-43
第五章锰离子与核酸共振光散射的研究与应用  43-49
  第一节实验部分  43-44
  第二节结果与讨论  44-48
  第三节合成样品分析  48-49
参考文献  49-57
附录  57-58
致谢  58

共振光散射技术在核酸分析中的研究及其应用

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