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骨髓间充质干细胞体外诱导分化为内皮细胞的实验研究

作 者: 贾鹂
导 师: 白俊清;李琪佳
学 校: 华北煤炭医学院
专 业: 外科学
关键词: 血管化组织工程骨 骨髓间充质干细胞 内皮细胞 冻干脱钙骨基质 生物相容性
分类号: R329
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要


目的检测骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导分化为内皮细胞(ECs)的能力,评价其与同种异体冻干脱钙骨基质(fdDBM)的生物相容性,为构建血管化组织工程骨提供理论基础。方法1.全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,8h后进行首次全量换液,MTT法检测第三代BMSCs的生长情况。2.内皮细胞条件培养基(10ng/ml VEGF, 2ng/ml bFGF, 2%FBS)体外诱导第三代BMSCs向ECs分化。诱导分化21d后,通过倒置相差显微镜、透射电镜及CD31与CD34抗原免疫细胞化学染色检测细胞形态、超微结构与表型的变化。MTT法检测BMSCs源性ECs的增殖特性,绘制生长曲线。3.利用实时荧光定量PCR技术,以主动脉血管内皮细胞(VECs)为阳性对照组,检测BMSCs源性ECs的基因(Flt-1, Flk-1, Tie-2, eNOS)相对表达量,分析BMSCs向内皮细胞分化的程度。4.一氧化氮试剂盒检测BMSCs向ECs诱导分化21d后的细胞功能。5. BMSCs源性ECs与同种异体fdDBM复合培养,倒置相差显微镜与扫描电镜观察细胞接种1d、3d、7d后与支架材料的粘附情况;MTT法检测ECs在支架上的增殖情况,以单纯细胞培养组为对照组。结果1. BMSCs的分离培养全骨髓法培养的BMSCs呈长梭形,胞核圆形或椭圆形,位于细胞中央,大约12d后,细胞汇合,排列具有方向性。生长曲线显示第三代BMSCs具有干细胞的增殖能力。2. BMSCs向内皮细胞谱系诱导分化及鉴定加入内皮细胞条件培养基后,细胞生长缓慢,胞体逐渐缩短,呈扁圆形或短梭形,14d左右可见典型的细胞簇形成,21d后细胞呈单层“铺路石样”排列,可见“血管腔样”结构。透射电镜可观察到内皮细胞最具特征性的W-P小体。CD31、CD34抗原免疫细胞化学染色均阳性表达,且CD34阳性单位值高于CD31,差异有统计学意义(p<0.05)。MTT法检测结果显示ECs仍保持BMSCs的增殖特性,生长曲线呈指数增长,短期培养无明显衰老现象。3.实时荧光定量PCR检测①Flt-1mRNA:BMSCs源性ECs表达量与BMSCs无明显差异(p>0.05),明显低于VECs(p<0.05);②Flk-1mRNA:BMSCs源性ECs表达量较BMSCs明显上调(p<0.05),与VECs无明显差异(p>0.05);③Tie-2mRNA与eNOSmRNA:BMSCs源性ECs与VECs无明显差异(p>0.05),BMSCs中没有表达。4. BMSCs源性ECs的功能检测在BMSCs向ECs诱导分化21天的细胞培养上清液中没有检测的NO的含量。5. BMSCs源性ECs与同种异体fdDBM的生物相容性BMSCs源性ECs可以在同种异体fdDBM上较好地粘附、增殖。MTT结果显示:细胞接种第1~3d,实验组细胞量明显少于对照组(p<0.05); 5d时,两组无明显差异(p>0.05);7~9d,支架上细胞数量明显多于对照组(p<0.05)。结论1. VEGF(10ng/ml)和bFGF(2ng/ml)协同作用与低增殖(2%FBS)条件诱导3周后,BMSCs可成功拥有ECs形态、超微结构与特异性表面抗原。2. BMSCs源性ECs基因水平与成熟血管内皮细胞无明显差异,但细胞功能尚不完全。3. BMSCs源性ECs与同种异体fdDBM生物相容性好,材料对细胞黏附与增殖无明显影响,适用于体内修复研究。

全文目录


中文摘要  3-5
英文摘要  5-8
英文缩写  8-9
研究论文 骨髓间充质干细胞体外诱导分化为内皮细胞的实验研究  9-54
  前言  9-11
  材料与方法  11-22
  结果  22-30
  讨论  30-38
  结论  38-39
  参考文献  39-45
  附图  45-54
综述 组织工程骨血管化影响因素的研究进展  54-72
  参考文献  66-72
致谢  72-73
个人简历  73

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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