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小麦1B单染色体DNA文库的构建及其鉴定

作　者: 张发云
导　师: 晏月明；胡赞民
学　校: 首都师范大学
专　业: 分子遗传学
关键词: 小麦染色体微分离及微克隆 LA-PCR 染色体特异性DNA文库 PCR扩增
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

以普通小麦(Triticum aestivum L.)品种“京411”为材料，采用单条染色体微分离、微切割及微克隆方法，建立了小麦1B单染色体DNA文库，并对克隆子进行了分析、鉴定。它将为获得位于小麦1B染色体上的探针，建立1B染色体上高密度分子标记连锁图谱以及克隆与分子标记紧密连锁的重要基因奠定基础。本研究的主要内容从结果如下： 1．小麦1B单染色体微玻璃针法微切割、微分离及其体外扩增实验体系的建立用微玻璃针法将“京411”细胞中划分裂相1B单染色体挑出放入Eppendorf管中，经蛋白酶K消化及Sau3A酶切后，用Sau3A接头介导的PCR(linker-adaptor PCR，LA-PCR)进行两轮体外扩增。鉴定结果表明，扩增片段长度在300-2500 bp之间，大多数集中于1000 bp。经Southern杂交分析证明，所扩增片段来自小麦基因组。与前人报道相比，本实验体系微分离染色体精确，易于操作，且费用较低。用显微切割法微分离与微克隆小麦1B单染色体在国内外尚未见类似报道。 2．小麦1B单染色体探针池的建立与克隆子分析采用上述实验体系，对经接头介导的PCR扩增获得的小麦1B单染色体DNA进行克隆，建立了1B单染色体DNA文库。利用Southern杂交、点杂交等技术，从插入片段来源、大小、组成等方面对微克隆文库进行分析。文库克隆子数目为248000个，对其中随机挑选的100个克隆进行分析表明，插入片段大小主要分布在500—2000bp，平均大小在1000bp左右；单、低拷贝序列占39.6％，中、高拷贝序列占50.4％，质粒空载率平均约为10％。与已有的染色体或染色体片段文库相比，在插入片段长度上明显优于以前的报道，其它特性近似。该微克隆文库可提供大量小麦1B单染色体区域特异性探针，为该染色体或染色体特定区段高密度遗传图谱及精细物理图谱的构建，以及高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)等重要基因的分离奠定了基础。同时，该实验体系对其它作物也具有参考意义。利川一对小麦IB i色体特异性微卫汪探旬引物＊g＊498J 对扩增产物来源进行验证，证实扩增产物来源于小麦旧染色体。同时从另一方面也证实染色体微克隆文库1－in含有大量微卫星序列，具有开发微卫星探针的潜力。 3．小麦 IB单染色体 DNA的 PCR扩增与初步分析参照己发表的小麦IIMW｛S核昔酸序列设计引物扩增＊单染色体卜A－PCR产物，处得一新的序列，这一序列与Genb。；。k收录的序列相比无同源性。因此需要进一步的研究以确定该序列是否为IB染色体专化序列。

全文目录

附表与插图  6-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
综述Ⅰ 小麦HMW-GS基因克隆研究进展  11-21
  1．高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）及其与面包烘烤品质的关系  11-12
  2． HMW-GS的遗传模式及其编码基因的结构特点  12-13
  3． HMW-GS基因分子克隆研究概况  13-16
  4．小麦HMW-GS基因克隆方法的探索及展望  16-19
  5．利用转基因技术对小麦品质改良的研究  19-21
综述Ⅱ 染色体微切割、微分离及微克隆技术的研究与应用  21-32
  1．历史回顾  21-23
  2．主要操作技术流程  23-26
  3．显微切割技术在动物及人类遗传学中的应用  26-30
  4．显微切割技术在植物中的应用及研究展望  30-32
前言  32-33
一材料和方法  33-44
  1．染色体标本制备  33
  2．小麦1B单染色体的显微分离  33-34
  3． Sau3A接头（linker adaptor）的制备及单染色体的体外扩增  34-35
  4．小麦基因组总DNA的提取与Southern杂交分析  35-38
  5．利用微卫星探针验证扩增物来源  38-39
  6．染色体片段扩增产物DNA文库的构建及分析  39-42
  7．从小麦1B单染色体LA-PCR二轮产物中扩增特异序列  42-44
二实验结果与分析  44-52
  1．小麦1B单染色体的显微分离  44-47
  2．小麦1B单染色体的体外扩增与Southern杂交分析  47
  3．利用一对微卫星引物PCR扩增验证LA-PCR二轮扩增产物来源  47-50
  4．小麦1B单染色体探针池的建立与分析鉴定  50-51
  5． HMW-GS序列的扩增结果及初步分析  51-52
三讨论  52-61
  1．显微分离小麦1B单染色体方法  53
  2．小麦1B单染色体的体外扩增  53-54
  3．应用微卫星标记验证染色体扩增产物来源  54-55
  4．本研究所构建的小麦1B单染色体文库质量分析  55-56
  5．对小麦1B单染色体DNA的PCR扩增及对后续工作的讨论  56-57
  6． 1B单染色体DNA探针池建立的意义及今后可能的用途  57-61
参考文献  61-72

小麦1B单染色体DNA文库的构建及其鉴定

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