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A类清道夫受体通路抑制内质网应激诱导的巨噬细胞自噬

作　者: 黄汉鹏
导　师: 陈琪
学　校: 南京医科大学
专　业: 病理生理学
关键词: A类清道夫受体 岩藻多糖 LC3 mTOR 自噬 凋亡 巨噬细胞
分类号: R730.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的:关于A类清道夫受体(scavenger receptor A, SR-A)通过何种途径促进内质网应激(ER stress)诱导巨噬细胞凋亡的机制至今尚未完全阐明。本课题应用SR-A的配体岩藻聚糖硫酸酯(fucoidan)作为工具药,深入研究了SR-A如何促进内质网应激诱导的巨噬细胞凋亡的作用机制和下游信号通路,从而为阻止巨噬细胞凋亡、防治动脉粥样硬化斑块进展提供新的途径。方法:本研究首先在小鼠RAW264.7巨噬细胞上使用毒胡萝卜素(Thapsigargin ,Tg)复制内质网应激模型,在此基础上不给予或给予fucoidan处理后,通过Western blot检测LC3(microtubule associated protein light chain 3)的表达从而反映自噬发生水平的变化。同时给予稳定表达GFP-LC3(Green fluorescent protein-LC3)的RAW264.7细胞不同处理后,通过激光共聚焦显微镜直接观察自噬体形成的变化。在明确fucoidan对内质网应激所诱导的自噬是否产生影响后,探讨fucoidan通过激活何种信号途径调控自噬的发生水平。信号通路的检测主要依赖于Western blot技术。本课题重点观察了fucoidan是否对AKT/mTOR/p70S6K信号通路产生影响,接着使用mTOR特异性阻断剂Rapamycin抑制AKT/mTOR/p70S6K信号通路,并用AnnexinV/PI双染流式细胞仪和Western blot方法测定细胞的凋亡情况。最后利用SR-A基因敲除型和野生型小鼠腹腔巨噬细胞,研究了SR-A与AKT/mTOR/p70S6K信号通路改变之间的可能联系。结果:用Tg和Tg+Fucoidan分别处理RAW264.7细胞8-12小时后,发现Tg+fucoidan处理组LC3-Ⅱ表达较Tg处理组明显减弱,表明fucoidan和Tg共处理后明显抑制了Tg诱导的巨噬细胞自噬的形成。这种抑制效应在处理后12小时最为明显。同时,给予稳定表达GFP-LC3的RAW264.7细胞不同处理后,用激光共聚焦显微镜观察自噬体形成的变化,结果与western blot检测的LC3-II表达水平相一致,Tg+fucoidan共处理组后抑制了内质网应激诱导的自噬体的形成。为了阐明fucoidan通过何种通路抑制内质网诱导的自噬的形成,我们又对调控自噬的最关键信号通路mTOR信号通路进行了研究。结果显示Tg+fucoidan处理细胞4小时后,可明显激活AKT/mTOR/p70S6K信号通路,提示fucoidan可能通过激活AKT/mTOR/p70S6K信号通路,抑制内质网应激诱导的自噬形成。我们接着应用mTOR通路特异性抑制剂Rapamycin干扰AKT/mTOR/p70S6K信号通路,来观察细胞自噬水平的变化。当用Rapamycin预处理RAW264.7细胞30min后再给予Tg+fucoidan处理,发现p-AKT、p-mTOR和p-P70S6K磷酸化活性均被明显抑制,LC3-Ⅱ的表达明显上调。这些实验结果表明,阻断mTOR通路后,fucoidan抑制内质网应激所诱导的自噬的形成得到了解除,从而进一步证明了fucoidan通过激活AKT/mTOR/p70S6K信号通路,抑制了内质网应激诱导的自噬形成。随后,我们观察了给予Rapamycin干扰AKT/mTOR/p70S6K信号通路后对于Tg + fucoidan共处理组细胞凋亡率的影响。实验结果显示,Tg + fucoidan+Rap处理组与Tg + fucoidan处理组相比,细胞凋亡率明显降低。这就说明了fucoidan可能是通过激活AKT/mTOR/p70S6K信号通路,抑制了内质网应激诱导的自噬的形成,从而促进了巨噬细胞的大量凋亡。由于fucoidan是SR-A的配体,因此我们想进一步知道fucoidan激活AKT/mTOR/p70S6K信号通路是否通过SR-A所介导。于是SR-A基因敲除小鼠模型被用作试验。实验结果显示,Tg + fucoidan处理野生型(SR-A+/+)小鼠腹腔巨噬细胞后,与TG组相比,p-AKT、p-mTOR和p-P70S6K被明显激活。而在SR-A敲除(SRA-/-)小鼠腹腔巨噬细胞中,上述蛋白的表达差异均不明显。因此,fucoidan可能是通过与SRA结合后,激活了AKT/mTOR/p70S6K信号通路。结论:作为A类清道夫受体的配体,fucoidan与SR-A结合后,可能通过激活AKT-mTOR-p70S6K通路,抑制了由ER stress所诱导的巨噬细胞自噬的发生,从而促进了巨噬细胞的大量凋亡。

全文目录


中文摘要  4-7
英文摘要  7-10
第一章 前言  10-13
第二章 材料和方法  13-20
  实验材料  13-14
  实验方法  14-20
第三章 结果  20-32
  一、fucoidan 和 Tg 共处理后抑制了 Tg 诱导的巨噬细胞自噬的形成  20-23
  二、fucoidan 可以激活 mTOR 信号通路  23-25
  三、当阻断 mTOR 通路后 RAW264.7 细胞自噬和凋亡的变化  25-31
  四、fucoidan 激活 mTOR 通路是通过 SRA 介导的  31-32
第四章 分析与讨论  32-39
第五章 小结  39-41
参考文献  41-47
综述  47-60
  参考文献  56-60
致谢  60

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题 > 肿瘤病理学、病因学
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