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中国部分地区草坪丝核菌的融合群鉴定及生防木霉菌株的筛选

作　者: 张爱萍
导　师: 于金凤
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 草坪丝核菌融合群 5.8S rDNA-ITS 拮抗木霉抑制率
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

随着城市化进程的不断加快,草坪在城市绿化中的作用也越来越明显。然而由于不当的水肥管理和修剪,草坪丝核菌病害的发生也越来越严重。目前,在对病害的防治中,提倡综合防治,而生物防治,尤其是拮抗木霉在土传病害防治中的作用尤为显著。本研究对山东省青岛、东营、泰安、上海市、广东省广州等地的草坪丝核菌进行了系统研究并筛选出了对优势融合群具有明显拮抗作用的生防木霉菌株。具体结果有如下几个方面:1.从山东省青岛、东营、泰安、上海市、广东省广州等地采集草坪丝核菌病害标本,采用常规组织分离法分离菌株获得48个丝核菌菌株。融合群测定结果表明,这些菌株分别属于多核丝核菌的WAG-Z、AG1-IA、AG4-HG-I融合群及双核丝核菌的AG-A、AG-P、AG-L融合群构成,其中WAG-Z群出现频率最高,占全部菌株的70.83%,为优势融合群;其次是AG-A群,占14.59%;再依次为AG1-IA群,占分离菌株的8.34%;AG4-HG-I、AG-P和AG-L群均有1个菌株,均占分离菌株的2.08%。另外AG-P群、AG-L群和AG-A群是国内外首次从草坪上分离得到的三个融合群。2.分离获得的草坪丝核菌,其菌丝经DAPI染色后制成玻片,置于荧光显微镜下观察,发现草坪丝核菌的细胞核相大致分两种:多核和双核,其中AG1-IA融合群的菌株细胞核数目多为5-11个;AG4-HG-I融合群的菌株细胞核数目为3-10个;WAG-Z融合群的菌株核相较为复杂,有单核细胞、双核细胞及多核细胞,其中以多核为主;AG-P、AG-L和AG-A融合群的菌株均为双核。3.利用5.8SrDNA-ITS区序列分析法,对草坪丝核菌不同融合群菌株进行了分子鉴定。结果表明,所有测试菌株其5.8S rDNA序列高度保守,ITS1、ITS2区存在不同程度的差异,隶属不同融合群或不同亚群的菌株其5.8S rDNA-ITS区序列存在较大的差异,而相同融合群或亚群菌株的一致性较高,利用此基因序列对丝核菌不同融合群或亚群的菌株可以进行有效区分和鉴定。4.运用灰色关联度分析法,对10个初筛木霉菌株的生长速度、耐性、产孢量、抗生作用等8个主要性状指标进行综合评价和分析。结果表明,木霉菌株T05-037的灰色关联度ri=0.9064最大,其次是T05-066和T05-048菌株,其灰色关联度分别为0.8714和0.8712。表明T05-037、T05-066、T05-048这三个木霉菌株的综合性状与构建的理想的参考菌株接近程度大,是比较理想的拮抗丝核菌的木霉生防菌株。其中,T05-037菌株的综合评价结果最好。5.本试验筛选获得的优良木霉菌株T05– 037,利用形态分类学的方法初步将其鉴定为绿色木霉(Trichoderma viride)。利用室内平板对峙方法评价木霉菌株T05-037对隶属不同融合群丝核菌的抑制作用。结果表明,T05-037木霉菌对供试的分属4个不同融合群的丝核菌菌株都有较强的抑制作用(抑制率为55.52%-64.49%),其中T05-037菌株对属于WAG-Z融合群的丝核菌菌株抑制率最高,说明木霉菌株T05–037对草坪丝核菌病害具有良好的生防潜力。

全文目录

中英文缩略表  3-7
中文摘要  7-9
Abstract  9-11
1 引言  11-25
  1.1 草坪丝核菌病害的研究进展  11-14
    1.1.1 草坪丝核菌病害的症状  11-12
    1.1.2 病原菌  12
    1.1.3 发病规律  12-13
    1.1.4 防治措施  13-14
      1.1.4.1 选用抗病品种  13
      1.1.4.2 栽培技术措施  13
      1.1.4.3 物理防治  13
      1.1.4.4 化学防治  13-14
      1.1.4.5 生物防治  14
  1.2 丝核菌的分类  14-21
    1.2.1 丝核菌的国际分类框架  14-19
      1.2.1.1 多核丝核菌融合群的划分  15-17
      1.2.1.2 双核丝核菌及融合群划分  17-19
    1.2.2 分子生物学技术用于立枯丝核菌的分类研究  19-21
      1.2.2.1 DNA 中G+Cmol%含量分析用于立枯丝核菌种群鉴定  19-20
      1.2.2.2 DNA 指纹技术用于立枯丝核菌分类学研究  20-21
        1.2.2.2.1 RFLP 用于分离物所属融合群鉴定  20
        1.2.2.2.2 ARDRA 用于分离物所属融合群鉴定  20
        1.2.2.2.3 AFLP 用于探索融合群产生的原因  20
        1.2.2.2.4 RAPD 用于融合群的划分  20-21
        1.2.2.2.5 SSR 用于立枯丝核菌系统发育研究  21
      1.2.2.3 特异性 PCR 扩增鉴定病原菌-立枯丝核菌  21
      1.2.2.4 直接测序法进行融合群划分和遗传关系研究  21
  1.3 木霉生防作用研究进展  21-24
    1.3.1 拮抗木霉的主要种类  22
    1.3.2 木霉菌的拮抗对象  22
    1.3.3 拮抗机制  22-24
      1.3.3.1 竞争作用  22
      1.3.3.2 重寄生作用  22-23
      1.3.3.3 抗生作用  23
      1.3.3.4 诱导植物抗性作用  23
      1.3.3.5 水解酶启动植物的防御反应  23
      1.3.3.6 保护酶增强植物抗病性  23-24
      1.3.3.7 毒性蛋白作用  24
      1.3.3.8 协同拮抗作用  24
  1.4 本研究的目的意义  24-25
2 材料与方法  25-34
  2.1 供试菌株的采集和鉴定  25
  2.2 菌株的培养性状及核相观察  25-26
  2.3 菌丝融合群测定  26
  2.4 供试菌株DNA 的提取  26-28
    2.4.1 提取试剂  26-27
    2.4.2 DNA 提取步骤  27-28
  2.5 草坪丝核菌的5.8S rDNA-ITS区序列分析  28-31
    2.5.1 PCR 扩增  28-29
    2.5.2 特异性扩增片段的回收  29-30
    2.5.3 回收产物检测  30
    2.5.4 特异扩增片段的克隆  30
      2.5.4.1 克隆反应体系的建立  30
      2.5.4.2 转化  30
      2.5.4.3 单克隆检测  30
    2.5.5 序列测定及分析  30-31
  2.6 高效拮抗木霉菌株的筛选  31-34
    2.6.1 木霉菌株生长速度的测定  31
    2.6.2 平板对峙培养  31-32
    2.6.3 木霉耐性的测定  32
      2.6.3.1 耐温性  32
      2.6.3.2 耐酸碱性  32
      2.6.3.3 耐药性  32
    2.6.4 产孢量  32
    2.6.5 抗生作用  32
    2.6.6 数据处理  32-34
  2.7 高效拮抗木霉菌株的形态鉴定  34
  2.8 高效拮抗木霉菌株的生防效果测定  34
3 结果与分析  34-58
  3.1 三省市草坪丝核菌的融合群组成和分布  34-37
  3.2 草坪丝核菌的培养性状及核相观察  37-41
    3.2.1 培养性状观察  37-39
    3.2.2 菌株的核相观察  39-41
  3.3 草坪丝核菌的5.8S rDNA-ITS 区序列分析  41-53
    3.3.1 PCR 扩增结果  41
    3.3.2 序列的比较分析  41-53
  3.4 高效拮抗木霉菌株的筛选  53-57
    3.4.1 生长速度测定结果  53
    3.4.2 木霉菌株其它性状的测定结果  53-54
    3.4.3 供试菌株灰色关联系数的计算过程  54-56
    3.4.4 灰色关联分析  56-57
  3.5 木霉菌株T05-037 形态鉴定  57
  3.6 木霉菌株T05-037 对草坪丝核菌的抑制作用  57-58
4. 结论与讨论  58-61
  4.1 关于五地草坪丝核菌的融合群组成  58-59
  4.2 关于丝核菌的细胞核染色  59-60
  4.3 草坪丝核菌生防木霉菌株的筛选结果  60-61
5 参考文献  61-68
6 致谢  68-69
7 攻读学位期间发表论文  69-70
高校教师硕士学位论文内容简介及自评  70

中国部分地区草坪丝核菌的融合群鉴定及生防木霉菌株的筛选

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