学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

快速检测鱼类淋巴囊肿病毒和海洋双RNA病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用

作　者: 李琼
导　师: 陈昌福；岳志芹
学　校: 华中农业大学
专　业: 水产养殖
关键词: 环介导恒温扩增(LAMP) 淋巴囊肿病毒(LCDV) 海洋双RNA病毒(MABV) 快速检测
分类号: S948
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 31次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus,LCDV)广泛分布于世界各地的淡水、半咸水和海水中,可感染9目34科共计140种以上鱼类,是对鱼类危害较为严重的病毒病之一,其感染率可高达80%,死亡率可达30%。本研究根据GenBank登录的淋巴囊肿病毒的主要衣壳蛋白(MCP)基因序列(AB212999),选择其高度保守区域,利用Primer Explorer V3软件进行引物设计,建立了用于检测淋巴囊肿病毒的环介导恒温扩增方法,对LCDV-LAMP反应条件进行了优化,评估了该方法的特异性、灵敏度并用建立的方法对109尾牙鲆进行了检测。特异性试验证实,该方法只能检测LCDV核酸,与流行性造血器官坏死病毒、虎纹蛙病毒、蛙虹彩病毒、新加坡石斑虹彩病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒及对虾白斑综合症病毒都无交叉反应,具有高度的特异性。将LAMP与常规PCR及实时定量PCR的检测限进行比较分析,结果表明LAMP与实时定量PCR的检测限一致约为15龟,比常规PCR灵敏度高10倍。用建立的LCDV-LAMP与常规PCR检测109尾牙鲆样品,结果显示,两者对健康和发病严重的样品检测结果一致,但对无临床症状的样品存在8尾差异;经2次实时定量PCR复检差异样品,均与LAMP一致,表明LAMP较常规PCR的检测灵敏度更高,而且从样品的制备到获得结果仅需2 h,具有检测周期短的优势。以上结果表明,采用LAMP法检测淋巴囊肿病毒具有特异性好、灵敏度高、检测耗时短等特点,比较适合养殖场、出入境口岸进行淋巴囊肿病毒的现场、即时检测。海洋双RNA病毒(Marine birnavirus,MABV)广泛分布于世界各地的海水中,可感染30科11种软体、4种甲壳动物和10多种鱼类,特别是对鲫幼鱼危害严重的病毒病之一,其感染率可高达85%,死亡率可达62%。本研究根据GenBank提供的海洋双RNA病毒聚合蛋白(polyprotein)的VP2基因序列(D61384),利用PrimerExplorer V3软件进行引物设计,建立了海洋双RNA病毒的反转录环介导恒温扩增方法。对MABV RT-LAMP反应条件进行了优化,评估了该方法的特异性和灵敏度,并采用优化了的方法对养殖场送检的鲈鱼、真鲷、大菱鲆和牙鲆各30尾进行MABV的检测。结果显示,该方法对MABV核酸有高度的特异性,与染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、鲤春血症病毒、病毒性出血败血症病毒及病毒性神经坏死病毒都无交叉反应。灵敏性试验发现,该方法最低检测限为16.6fg总RNA,与实时定量RT-PCR的检测限一致,但比常规PCR灵敏度高10倍。对养殖场送检的120份样品进行RT-LAMP和实时定量PCR海洋双RNA病毒检测,结果显示两种方法的检测结果完全一致,表明RT-LAMP具有更高的灵敏度。以上结果表明,本研究所建立的MABV RT-LAMP能对海洋双RNA病毒进行准确、快速的检测,具有特异性好、灵敏度高、检测成本低廉等优点,可用于基层实验室和出入境检疫对海洋双RNA病毒属的疫情监测。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略语表  10-12
第一章 文献综述  12-26
  1.1 核酸恒温扩增技术的分类和原理  12-18
    1.1.1 NASBA法  12-13
    1.1.2 SDA法  13
    1.1.3 HDA法  13-14
    1.1.4 RCA法  14-15
    1.1.5 LAMP法  15-18
  1.2 LAMP技术与其他恒温扩增技术相比的优势  18-20
  1.3 LAMP技术的应用  20-23
    1.3.1 定量分析扩增产物  20
    1.3.2 在病原微生物检测中的应用  20-22
    1.3.3 其它方面的应用  22
    1.3.4 LAMP技术的展望  22-23
  1.4 LAMP技术在水生动物疾病检测的应用现状  23-26
    1.4.1 水生动物病原微生物的检测  23-25
    1.4.2 展望  25-26
第二章 淋巴囊肿病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用  26-37
  2.1 材料与方法  27-30
    2.1.1 试验材料  27
    2.1.2 试剂与仪器  27
    2.1.3 DNA提取  27-28
    2.1.4 引物的设计  28-29
    2.1.5 LAMP反应体系优化及扩增产物检测方法  29
    2.1.6 特异性分析  29
    2.1.7 灵敏度分析  29-30
    2.1.8 扩大试验  30
  2.2 实验结果  30-35
    2.2.1 LAMP的反应体系优化结果  30-32
    2.2.2 特异性实验结果  32-33
    2.2.3 LAMP与常规PCR和实时定量PCR检测限的比较  33-35
    2.2.4 扩大试验结果  35
  2.3 讨论  35-37
第三章 海洋双RNA病毒反转录环介导等温扩增检测方法的建立与应用  37-47
  3.1 材料与方法  38-41
    3.1.1 试验材料  38
    3.1.2 试剂与仪器  38
    3.1.3 引物设计  38-39
    3.1.4 RT-LAMP反应体系优化及扩增产物的检测  39
    3.1.5 特异性分析  39-40
    3.1.6 灵敏度分析  40
    3.1.7 扩大试验  40-41
  3.2 实验结果  41-45
    3.2.1 RT-LAMP的反应体系优化结果  41-42
    3.2.2 特异性实验结果  42-43
    3.2.3 LAMP与常规PCR和实时定量PCR检测限的比较  43-45
    3.2.4 扩大试验结果  45
  3.3 讨论  45-47
第四章 结论  47-49
参考文献  49-59
致谢  59-60

相似论文

  1. 层层组装法制备SERS基底及应用于有机小分子检测的研究,O657.3
  2. 乳品中大肠菌群快速检测研究,TS252.7
  3. 原料奶中嗜冷菌的快速检测,TS252.7
  4. 环孢菌素A血药浓度快速检测试纸的初步研制及验证,R96
  5. 阻抗法快速检测牛奶中菌落总数的研究,TS252.7
  6. 功能化纳米粒子的制备及其在毒素快速检测中的应用研究,TB383.1
  7. 同步荧光法快速检测苯并[a]芘的研究,O657.3
  8. 劣质过磷酸钙现场快速检测,TQ442
  9. 环境内分泌干扰物壬基酚快速生物检测技术研究,X830
  10. 养殖大菱鲆病原菌迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及快速检测技术的建立,S943
  11. 哈维氏弧菌毒力相关基因的筛查及快速检测技术研究,S941
  12. 副溶血弧菌分子检测靶点的筛选及其内标PCR体系的建立,R155.5
  13. 纳米电极的制备及其在快速检测水体中大肠杆菌的电分析化学研究,O657.1
  14. 近红外光谱技术在原料奶掺假快速检测及新鲜度检测中的应用研究,TS252.7
  15. 国境口岸食品卫生监督新模式实施效果研究,R155.5
  16. 环介导等温扩增技术快速检测肉中沙门氏菌的研究,TS251.7
  17. 胶体金免疫层析法快速检测流感病毒抗原方法的建立及应用研究,R446.6
  18. 磺胺二甲基嘧啶单克隆抗体的制备及免疫学快速检测方法的建立,S859.84
  19. 淋巴囊肿病毒对牙鲆鳃细胞的感染特征及其影响因子效应的数学模型分析,S943
  20. 食品中细菌总数快速检测前处理方法的研究,TS207.4

中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 水产药物学、药理学
© 2012 www.xueweilunwen.com