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植物广谱抗病基因克隆及载体构建的研究

作　者: 刘永光
导　师: 车代弟
学　校: 东北农业大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 园林植物 广谱抗病 NPR1 TGA2 载体构建
分类号: S68
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


园林植物多进行保护地栽培,高温高湿的局部小气候使园林植物更容易感染多种病害,而一旦染病则会严重影响园林植物的观赏价值,造成经济上的重大损失。一方面,园林植物抗病育种周期长,能够用做抗病育种的园林植物种质资源贫乏,短时间内园林植物抗病育种难以有所大的突破;另一方面,日益蓬勃发展的园林业迫切需要能够抵抗多种病害的广谱抗病商品植株。系统获得性抗性(Systematic acquired resistance, SAR)是植物抵御病原菌侵染的最有效手段,我们可以利用SAR信号传导途径中的关键功能基因来启动园林植物自然防御系统,达到广谱抗病的目的。NPR1基因在植物的SAR发生中起着重要的作用,通过NPR1基因的过量表达可以诱导植物SAR的起始,使植物产生对多种病原菌的广谱抗病性。TGA2转录因子能直接和多个病程相关基因启动子结合感应SA的调节元件结合,能够增强病程相关蛋白的表达水平,特异的诱导植物产生SAR,从而启动植物的广谱抗病。本研究主要研究成果如下:1.通过反转录PCR,从拟南芥中克隆出广谱抗病基因NPR1。测序结果显示所克隆NPR1基因全长1782bp,与NCBI所登陆的基因100%同源。2.通过反转录PCR,从拟南芥中克隆出能够诱导广谱抗病的TGA2转录因子。测序结果显示所克隆TGA2基因全长993bp,与NCBI所登陆的基因99.8%同源,发生了两个碱基的置换,但所翻译氨基酸没有变化。3.将NPR1基因正向插入中间载体的CaMV35S启动子和T-nos终止子之间,构建出p35ST-NPR1植物表达载体。4.将TGA2转录因子正向插入中间载体的CaMV35S启动子和T-nos终止子之间,构建出p35ST-TGA2植物表达载体。5.将NPR1基因正向插入到pMXB10蛋白表达载体中,构建出pMXB10-NPR1蛋白表达载体。6.将TGA2转录因子正向插入到pMXB10蛋白表达载体中,构建出pMXB10-TGA2蛋白表达载体。

全文目录


中文摘要  8-9
英文摘要  9-11
1 引言  11-31
  1.1 研究的目的和意义  11-12
  1.2 植物抗病基因工程研究进展  12-20
    1.2.1 植物抗病机理  12-15
    1.2.2 植物抗病基因工程策略  15-17
    1.2.3 植物广谱抗病基因策略和研究  17-20
  1.3 广谱抗病基因NPR1 的研究进展  20-22
  1.4 广谱抗病TGA2 转录因子的研究进展  22-23
  1.5 园林植物育种的研究进展  23-29
    1.5.1 园林植物传统育种的现状  23-24
    1.5.2 园林植物基因工程育种研究进展  24-27
    1.5.3 基因工程在园林植物育种应用中存在的问题  27-28
    1.5.4 园林植物基因工程育种展望  28-29
  1.6 PMX810 蛋白表达纯化载体简介  29-31
2 材料与方法  31-44
  2.1 实验材料  31-33
    2.1.1 植物材料  31
    2.1.2 菌种和质粒  31
    2.1.3 分子生物学及生化试剂  31
    2.1.4 寡聚核苷酸引物  31-32
    2.1.5 培养基  32
    2.1.6 常用的试剂  32-33
  2.2 实验方法  33-44
    2.2.1 植物材料拟南芥的获得  33
    2.2.2 拟南芥NPR1 基因的克隆  33-38
    2.2.3 拟南芥TGA2 转录因子基因的克隆  38-43
    2.2.4 植物表达载体的构建与鉴定  43
    2.2.5 蛋白表达载体的构建与鉴定  43-44
3 结果分析  44-52
  3.1 拟南芥抗病基因NPR1 的克隆及载体构建  44-47
    3.1.1 拟南芥总RNA 的提取  44
    3.1.2 RT-PCR 扩增NPR1 基因  44-45
    3.1.3 拟南芥NPR1 基因的测序比对分析  45
    3.1.4 植物表达载体p355T-NPR1 的酶切验证  45-46
    3.1.5 蛋白表达载体PMX810-NPR1 的酶切验证  46-47
  3.2 拟南芥TGA2 转录因子的克隆及载体构建  47-52
    3.2.1 TRizol 法提取拟南芥总RNA  47-48
    3.2.2 RT-PCR 扩增TGA2 转录因子  48-49
    3.2.3 拟南芥TGA2 转录因子的测序结果分析  49-50
    3.2.4 植物表达载体p355T-TGA2 的酶切验证  50-51
    3.2.5 蛋白表达载体PMX810-TGA2 的酶切验证  51-52
4 讨论  52-56
  4.1 植物广谱抗病基因和园林植物抗病育种  52-53
  4.2 实验过程中应该注意的问题  53-56
    4.2.1 核糖核酸(RNA)提取中应注意的问题  53-54
    4.2.2 引物设计  54
    4.2.3 PCR 中应该注意的事项  54-55
    4.2.4 载体构建  55
    4.2.5 实验中意外的人为因素  55-56
5 结论  56-57
致谢  57-58
参考文献  58-66
附录  66-74
攻读学位期间发表的学术论文  74

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 观赏园艺（花卉和观赏树木）
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