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四川省散斑壳属若干种的鉴定、培养及遗传多样性分析

作　者: 杨静
导　师: 刘应高
学　校: 四川农业大学
专　业: 森林保护学
关键词: 散斑壳属形态学鉴定培养性状遗传多样性分析
分类号: S763.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 43次
引　用: 2次
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内容摘要

松树是四川省林区的主要树种之一，既有大面积的天然林，也有范围广泛的人工林。近年来，松落针病在四川林区普遍发生，部分地区危害严重。作者对省内主要松树林区的松落针病病情进行了调查，发现导致松针感病脱落的病原菌主要为散斑壳属真菌，并对其作了较为系统的研究，主要内容包括：病原菌种的形态学鉴定、培养特性观察及种间、种内遗传多样性分析。以Minter（1981）的分类标准为主要依据，对采自四川省主要松树林区（雅安名山、甘孜泸定、甘孜康定、眉山丹棱、成都蒲江、内江资中、自贡、宜宾、泸州、南充、达州、西昌冕宁）的40余号病原菌标本进行整理编号、种的形态学鉴定、分离培养。共查明散斑壳属真菌7种，分别是：针叶树散斑壳（Lophodermium conigenum）、松针散斑壳（Lophodermi pinastri）、四川散斑壳（Lophodermium sichuanense）、印度散斑壳（Lophodermium indianum）、南方散斑壳（Lophodermium australe）、二郎山散斑壳（Lophodermium erlangshanense）（新种暂定名）、库曼散斑壳（Lophodermium kumaunicum）；其中，二郎山散斑壳为新种，库曼散斑壳为四川新记录种。采用子囊果组织分离法对部分成熟材料进行分离培养，获得24个菌株，并对其培养性状进行了观察记录，为进一步进行RAPD遗传多样性分析奠定了基础。采用改良二次沉淀法获得了24个散斑壳菌株的基因组DNA，并利用RAPD技术进行种间、种内遗传多样性分析。RAPD分析对反应条件非常灵敏，故稳定性和重复性较差，为了保证RAPD结果的可靠性和重复性，本论文探讨了DNA模板、Taq酶、Mg离子、dNTPs、引物等组分浓度对散斑壳属真菌RAPD反应的影响，并获得了最佳反应条件：25μlPCR反应体积，10×Taq酶缓冲液（2.5μl），1.5UTaq酶，20ng DNA模板，0.4mmol／LdNTPs，4.0mmol／L Mg²⁺，0.48μmol／L引物，10.2μlddH₂O。经过筛选，从160条RAPD引物中得到11条可用于RAPD分析的最佳引物，其扩增图谱具有谱带清晰、带型稳定、多态性好等特点；利用这11个引物对24个散斑壳属菌株进行PCR扩增，共获得217个位点，多态性位点214个，多态率为98.6％。利用NTSYS-PC2.1软件中的UPGMA法构建遗传图谱，结果表明：同种及近似种菌株能够较好地聚在一起，且RAPD聚类结果与形态学特征具有一定的相关性；同一种内各菌株由于地域分隔而产生较大的遗传分化；相同地理来源的同一菌种由于寄主来源不同也能造成种内不同程度的遗传分化。

全文目录

中文摘要  6-7
英文摘要  7-9
前言  9
1 文献综述  9-15
  1.1 散斑壳属真菌的分类  9-10
  1.2 散斑壳属的生活史  10-11
  1.3 散斑壳属真菌的分离培养  11
  1.4 菌物群体遗传多样性研究  11-15
    1.4.1 同工酶标记在菌物遗传多样性研究中的应用  12-13
    1.4.2 DNA分子标记及其相关技术在菌物遗传多样性研究中的应用  13-15
2 材料与方法  15-21
  2.1 样品的采集与整理  15
  2.2 形态学鉴定  15-16
    2.2.1 外部形态观察  15
    2.2.2 制片及显微检查  15
    2.2.3 描述及绘图  15-16
  2.3 发病率的统计  16
  2.4 培养性状的观察及记载  16-17
    2.4.1 病原菌的分离培养  16
    2.4.2 培养性状的观察  16
    2.4.3 诱发子囊果的产生  16-17
      2.4.3.1 降低养分浓度诱发法  16
      2.4.3.2 改变碳源诱发法  16
      2.4.3.3 不同培养基诱发子囊果的产生  16-17
  2.5 散斑壳属的遗传多样性分析  17-21
    2.5.1 供试菌株  17-18
    2.5.2 仪器与试剂  18
      2.5.2.1 主要试剂  18
      2.5.2.2 仪器  18
    2.5.3 菌丝体的获得  18
    2.5.4 DNA的提取及检测  18-19
      2.5.4.1 DNA的提取  18-19
      2.5.4.2 DNA的检测及定量  19
    2.5.5 基因组DNA的PCR扩增  19-21
      2.5.5.1 引物的筛选  19-20
      2.5.5.2 RAPD反应体系的优化  20
      2.5.5.3 反应条件的建立  20-21
    2.5.6 反应产物的检测  21
    2.5.7 数据处理  21
3 结果与分析  21-40
  3.1 种的描述  21-24
    3.1.1 针叶树散斑壳(图版Ⅰ-1、Ⅰ-2)  21-22
    3.1.2 松针散斑壳(图版Ⅰ-3)  22
    3.1.3 四川散斑壳(图版Ⅰ-4)  22-23
    3.1.4 印度散斑壳(图版Ⅰ-5)  23
    3.1.5 南方散斑壳(图版Ⅰ-6)  23-24
    3.1.6 二郎山散斑壳(图版Ⅱ-1、Ⅱ-2)  24
    3.1.7 库曼散斑壳(图版Ⅱ-3、图版Ⅱ-4)  24
  3.2 发病率的统计  24
  3.3 培养性状的记述  24-30
  3.4 诱发子囊果的产生  30-31
    3.4.1 降低养分浓度诱发法  30
    3.4.2 改变碳源诱发法  30
    3.4.3 不同培养基诱发子囊果的产生  30-31
  3.5 散斑壳菌遗传多样性的RAPD分析  31-40
    3.5.1 DNA的提取  31
    3.5.2 引物的筛选  31
    3.5.3 PCR反应条件的优化  31-34
      3.5.3.1 dNTPs浓度对PCR的影响  32
      3.5.3.2 Mg~(2+)浓度对PCR的影响  32
      3.5.3.3 DNA模板的量对PCR的影响  32-33
      3.5.3.4 Taq酶用量对PCR的影响  33-34
      3.5.3.5 RAPD引物浓度对PCR的影响  34
    3.5.4 RAPD分析  34-40
      3.5.4.1 扩增图谱的特征  34
      3.5.4.2 系统聚类分析  34-40
        3.5.4.2.1 供试的24株散斑壳菌株系统聚类分析  34-38
        3.5.4.2.2 系统聚类与地理来源相关性分析  38-39
        3.5.4.2.3 系统聚类与寄主的相关性分析  39-40
4 结论  40-41
5 讨论  41-43
参考文献  43-49
图版  49-55
致谢  55-56

四川省散斑壳属若干种的鉴定、培养及遗传多样性分析

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